第八章核酸的酶促降解和解析

• （1）识别双链DNA上的特定位点即“回文 结构”（长度在4——8个碱基对范围内， 从前往后读和从后往前读完全一样的碱基 序列），切割后错开的切口会产生互补的 单链末端（粘性末端、平末端）。 • （2）降解外面侵入的DNA，但不降解自身 细胞的DNA，因为自身DNA的酶切位点上经 甲基化修饰而得到保护。
（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
产生粘性末端
EcoR V
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
Recognize site
1-1.5kb
cut
（3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
2. II类限制性内切酶
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970 年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ
（1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序 列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。
痛风(Gout)
嘌呤碱分解代谢产生过多的尿酸正常人血浆中 尿酸含量为20-60mg/L，超过80mg/L时，由于其溶解 性很差，易形成尿酸钠结晶，沉积于男性的关节、 软组织、软骨、肾等 部位,导致关节炎、尿 路结石以及肾脏疾病， 引起疼痛或灼痛,即“痛 风症”。 摄取大量嘌呤食物或尿 酸排泄障碍时易患痛风症。
常用的DNA限制性内切酶的专一性
酶 辨认的序列和切口
‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥ ‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥ ‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥
说明 四核苷酸，平端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口
2、限制性核酸内切酶： • 发现： 1952， Smith Human 用T4 phage 感 染E.coli. 提出了限制与修饰现象。 细菌体内能识别并水解外源双源DNA的核酸内切 酶，产生3ˊ-OH和5ˊ-P。 有序列专一性，无碱基专一性 例： EcoRⅠ切割后，形成5ˊ-P单链粘性末端。
限制性核酸内切酶的生物学功能：
• IMP的合成 • （1）5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的生 成——起始步骤 • 磷酸核糖焦磷酸合成酶催化5-磷酸核 糖和ATP生成。
概 述

核酸的消化与吸收
食物核蛋白
蛋白质
胃酸
核酸（RNA及DNA）
胰核酸酶
核苷酸
胰、肠核苷酸酶
核苷 碱基
核苷酶
磷酸 戊糖
核酸是核苷酸以3’、5’-磷酸二酯键连成的 高聚物，核酸分解代谢的第一步就是分解为核 苷酸，作用于磷酸二酯键的酶称核酸酶（实质 是磷酸二脂酶）。 根据对底物的专一性可分为： 核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、非特异性核酸 酶。 根据酶的作用方式分：内切酶、外切酶。
2、核苷酶 ① 核苷磷酸化酶：广泛存在，反应可逆。
核苷磷酸化酶 核苷 + 磷酸 碱基 + 戊糖-1-磷酸
② 核苷水解酶：主要存在于植物、微生物中， 只水解核糖核苷，不可逆。
核苷水解酶
核糖核苷+ H2O 碱基 + 核糖
核酸
核酸酶
单核苷酸
核苷磷酸化酶
磷酸单脂酶
核苷
核苷酶
嘧啶（嘌呤）嘧啶（嘌呤） 核糖（脱氧核糖）
复习：
磷酸（P）
核酸
核苷酸
核苷
戊糖（R） 碱基（B）
戊糖：
5 HOCH2
O
H
OH H
1
5 HOCH2 4 H
4
H
O
H
3
OH
H
1 2 H
2 H OH OH
3
OH H
核 糖
脱氧核糖
嘌呤：
N1
NH2 N N N
O HN H2 N N N
腺嘌呤（A）
嘧啶：
N O N H
1
N 鸟嘌呤（ G）
O HN O N H CH3
NH2
HN O
O
N H
胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）
胸腺嘧啶（T）
核苷酸：
由磷酸、戊糖和碱基三种成分构成的化合物
NH2
N O O N 1 HO P OCH2O OH 1' OH H
磷酸脱氧胞苷（dCMP）
核苷酸的生物功能 ①合成核酸 ②是多种生物合成的活性中间物 糖原合成，UDP-G 磷脂合成，CDP-乙醇胺，CDP-二脂酰甘油。 ③生物能量的载体ATP、GTP ④腺苷酸是三种重要辅酶的组分 NAD、FAD、CoA ⑤信号分子cAMP、cGMP
5’3’-
CTGCA G G ACGTC
-3’ -5’
3. III类限制性内切酶
在完全肯定的位点切割DNA，但反应 需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨 酸）。
EcoP1: AGACC
EcoP15: CAGCAG 用途不大。
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 I型 多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM TGAN8TGCT AACN6GTGC 随机性切割 特异性切割 II 型 单功能 同源二聚体 Mg2+ III 型 双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ SAM GAGCC CAGCAG
一、核酸酶 1、核糖核酸酶 只水解RNA磷酸二酯键的酶（RNase），不同的RNase专 一性不同。 例：牛胰核糖核酸酶（ RNaseI ），作用位点是嘧啶核 苷-3’-磷酸与其它核苷酸间的连接键。 核糖核酸酶 T1（ RNaseT1 ），作用位点是 3’ -鸟苷酸与 其它核苷酸的5’-OH间的键。
Hind Ⅲ
Sal I Sma I
六核苷酸，平端切口
限制性内切酶的命名和意义
例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶
Eco R I
属名 种名 株名 序号
限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限 制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外 重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀， 用来解剖纤细的DNA分子。
第一节
核酸的酶促降解
食物中的核酸，经肠道酶系降解成各种核苷 酸，再在相关酶作用下，分解产生嘌呤、嘧啶、 核糖、脱氧核糖和磷酸，然后被吸收。 吸收到体内的嘌呤和嘧啶，大部分被分解， 少部分可再利用，合成核苷酸。 人和动物所需的核酸无须直接依赖于食物， 只要食物中有足够的磷酸盐、糖和蛋白质，核酸 就能在体内正常合成。
Alu I Bam H I I Eco R I
‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥
‥ ‥A A G C T T‥‥ ‥ ‥T T C G A A ‥‥ ‥ ‥G T C G A C ‥‥ ‥ ‥C A G C T G ‥‥ ‥ ‥C C C G G G ‥‥ ‥ ‥G G G C C C ‥‥
旋转对称序列
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游 24-26bp处
第二节
核苷酸的生物降解
核酸的分解代谢
核酸酶
核酸 核苷酸
核苷酸酶
核苷 + 磷酸
核苷磷酸化酶
碱基 + 戊糖-1-磷酸
一、核苷酸的降解
1、核苷酸酶 （磷酸单脂酶） 水解核苷酸，产生核苷和磷酸。 非特异性磷酸单酯酶：不论磷酸基在戊糖的 2’、 3’、5’，都能水解下来。 特异性磷酸单酯酶：只能水解 3’ 核苷酸或 5’ 核 苷酸（3’核苷酸酶、5’核苷酸酶）。
痛 风 的 尿 酸 钠 晶 体
三、嘧啶碱的降解 人和某些动物体内脱氨基过程有的发生在核苷 或核苷酸上。脱下的NH3可进一步转化成尿素 排出。
第三节
核苷酸的生物合成
• 核苷酸的合成途径一般有两条： • 1、从头合成：从最简单的原料如CO2、氨 基酸、甲酸盐等开始组装碱基环。 • 2、补救途径：从来自核酸降解的中间产物 或外源核苷、碱基直接合成核苷酸，不需 组装碱基环。
内切核酸酶对RNA的水解位点示意图
G A
Py
1´
Pu
Py
Py
p
G
A
C
U
p
p
5´
p
p
p
p
p
p
p
OH
3´
RNAase I
RNAase I
RNAase T1 Py：嘧啶
RNAase T1
Pu ：嘌呤
2、非特异性核酸酶 既可水解 RNA ，又可水解 DNA 磷酸二酯键的核酸 酶。 例： 小球菌核酸酶是内切酶，可作用于RNA或变性的 DNA，产生3’-核苷酸或寡核苷酸。 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二脂酶属于外切酶。 蛇毒磷酸二酯酶能从RNA或DNA链的游离的3’-OH 逐个水解，生成5’-核苷酸。 牛脾磷酸二酯酶从游离的5’-OH开始逐个水解， 生成3’核苷酸。
限制性核酸内切酶的类型
1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从 大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp 处随机切开一条单链。
磷酸核糖焦磷酸激酶
5-磷酸核糖 + ATP 5`-PRPP + AMP
总反应式： 5- 磷酸核糖 + CO2 + 甲川 THFA + 甲酰 THFA + 2Gln + Gly + Asp + 5ATP → IMP + 2THFA + 2Glu + 延 胡 索 酸 + 4ADP + 1AMP + 4Pi + PPi