治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考

China Licensed PharmacistＪａｎ．２０１３，Ｖｏｌ．１０Ｎｏ．１合理用药呵护公众健康１９８２年，重组人胰岛素作为人类历史上的第一种生物治疗药物被美国食品药品监督管理局（ＦＤＡ）批准进入市场，从此，重组生物制品开始逐步增多并在生物制品市场中占据越来越大的市场份额，特别是近年来单克隆抗体（以下简称单抗）类药物的发展，更受到业界的关注，越来越多的企业投入到单抗的开发和生产中来。

同时，随着一大批疗效明确的单抗药物专利即将到期，如：赫塞汀（曲妥珠单抗）、美罗华（利妥昔单抗）、爱必妥（西妥昔单抗）和类克（英利西单抗）等，许多医药企业通过生物仿制药的方式加入到单抗制品的开发和生产中。

随之而来的问题是，由于缺乏对单抗结构与其安全性和有效性间关系的深入了解，新加入企业和生物仿制药企业在单抗制品的质量控制方基金项目：“重大新药创制”科技重大专项（２００９ＺＸ０９３０７－００１）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２００７ＡＡ０２１６０１，２００７ＡＡ０２１２０４）作者简介：张峰，男，硕士，副主任技师。

研究方向：治疗性单克隆抗体的质量控制。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｆ５１２２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ治疗性单克隆抗体类制品质量控制标准的思考张峰综述孟淑芳审校（中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室，北京１０００５０）【摘要】治疗性单克隆抗体制品在肿瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治疗中均取得了显著疗效，其品种和市场份额逐年显著提高。

随着新的治疗性单克隆抗体制品的研发和上市，不同产品的质量控制研究，特别是新技术在质量控制中的应用被提到新的高度。

由于治疗性单克隆抗体制品结构和生产的复杂性，使得质量控制的复杂程度也相应提高。

本文结合治疗性单克隆抗体质量控制的工作经验和国际上的最新进展，对治疗性单克隆抗体质量控制项目设定、标准和方法进展进行论述。

【关键词】治疗性单克隆抗体；质量控制；方法；标准ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５４３３．２０１３．０１．００６The Quality Control of Therapeutic Monoclonal Antibody ProductsＺｈａｎｇＦｅｎｇ／ｗｒｉｔｉｎｇ，ＭｅｎｇＳｈｕｆａｎｇ／ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ（ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ）ABSTRACTＴｈｅｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｖｅｄｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒ，ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｖａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄｍａｒｋｅｔｓｈａｒｅｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｓｈａｖｅｒｉｓｅｎｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｙｙｅａｒａｆｔｅｒｙｅａｒ．Ａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍａｒｋｅｔｉｎｇｏｆｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｈａｓｂｅｅｎａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｓｅｐｒｏｄｕｃｔｓｓｏａｓｔｏｅｎｓｕｒｅｔｈｅｉｒｑｕａｌｉｔｙ．Ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｓｂｏｔｈｉｎｔｈｅｉｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｓｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｂｅｃｏｍｅｍｏｒｅｄｉｆｆｉｃｕｌｔ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｓｔａｎｄａｒｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｌａｔｅｓｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄａｎｄｏｕｒｗｏｒｋｉｎｇｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｉｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．KEY WORDSＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ；ＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌ；Ｍｅｔｈｏｄ；Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ中国执业药师·面往往通过模仿其他单抗质量控制项目和方法的方式解决质量控制问题，这种方式在确保实现质量控制目标方面存在一定的局限性。

同时，一大批新技术的出现和应用，极大地促进了单抗质量控制技术项目和方法的发展。

现结合工作经验和对单抗质量控制的理解对单抗质量控制项目和方法的研究现状进行讨论。

１抗体结构简介抗体为通过链间二硫键连接的２条重链和２条轻链构成的“Ｙ”形结构，重链和轻链通过链内二硫键形成多个结构域，其中重链和轻链Ｎ端的第１个结构域氨基酸序列多变，被称为可变区（ＶＨ和ＶＬ），二者为抗体同抗原结合的结构基础。

另外，重链和轻链分别有３个和１个结构域的氨基酸序列相对保守，被称为恒定区（ＣＨ和ＣＬ），重链的第２个恒定区（ＣＨ２）中存在１个Ｎ糖基化位点，该位点的糖基化对其发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒效应具有重要作用［１－２］，同时该糖基化位点上连接的寡糖链的唾液酸化程度对于抗体稳定性也存在重要影响［３］。

重链第３个恒定区（ＣＨ３）介导抗体同Ｆｃ受体和补体的结合，从而在抗体效应的发挥和清除中发挥重要作用。

不同的抗体由于其种类和亚类不同而在重链恒定区数目、附属结构和一些细微结构中存在一定差异。

治疗性单抗一般为人鼠嵌合、人源化或人源单抗，多为ＩｇＧ１亚类，可根据其治疗目的和作用机制选择其他亚类，如ＩｇＧ２ａ，并可在抗体基本结构的基础上对抗体结构进行改造，如：为了消除抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应而在大肠杆菌中表达或突变ＣＨ２糖基化位点；为了消除补体激活效应而采用单臂结构或Ｆ（ａｂ）２结构；为了提高对低抗原表达量细胞的杀伤效应而在单抗上偶联细胞毒性药物等［４］。

由于抗体对应不同的抗原特异性、其结构的复杂性、作用机制的多样性以及生产工艺的复杂性都会影响抗体的质量，因此需采用多种质量控制项目和方法对单抗的质量进行评价。

单抗的质量控制项目和方法选择是在对抗体结构与其安全性和有效性之间关系不断深入了解的基础上逐步发展的，同时，对方法的运用和对结果的解释也是在对分析方法的不断发展和深入理解的基础上而不断深入和变更的一个动态过程。

２单抗制品的质量控制项目及要求单抗制品同其他生物制品的要求一致，质量控制是贯穿终产品生产的全过程控制，从生产用起始材料或原材料的质量控制至终产品的质量控制，根据生产工艺的不同阶段设置不同的质量控制项目要求，本文主要讨论单抗原液至终产品的质量标准及相关要求。

总体上看，单抗的质量控制项目（见表１）主要包括一般项目、理化检测、含量、鉴别、纯度、活性、安全性等几个方面［５］，其中安全性方面检测包括：ＤＮＡ残留、宿主细胞蛋白残留、生产过程相关外源因子和异常毒性检测。

作为对纯化工艺去除外源因子能力的验证，宿主细胞ＤＮＡ、宿主细胞蛋白残留和生产过程相关外源因子的检测主要在注册阶段的原液样品中进行，考虑到最适样本的问题，这些项目在成品检测中可以不检测。

在产品质量标准设定和检测方法选择的过程中，应根据制品的具体情况选择合适的检测方法，并根据工艺的稳定性、产品的安全性和有效性以及方法本身的变异情况设定合适的质量标准。

由于对结构与功能间关系认识的不断深入和检测技术的不断发展，产品的检定方法和质量标准是一个不断发展提高的过程，下面就当前单抗制品的检测方法和质量标准进行说明和论述。

３单抗质量方法研究现状及其标准制定的注意事项从表１可以看出，对于一个质量控制项目可能会采用不同的方法，从不同的侧面反映单抗的质量，特别是近年来一些新技术应用于单抗的质量控制，对单抗制品的质量控制提供了更高的保障。

但同时也需考虑到，对于单抗，表１中所列出的项目只是一个较为普遍的原则，但并不是所有的检测方法都适用于每一种单抗制品，表中所规定的标准也并非适用于所有的制品，针对于某一个特定单抗来说，都会有一些特殊的因素需要考虑，下面就不同检测方法在单抗质量控制中的作用及其标准制定时需要考虑的问题作简单分析。

在一般检测项目中的可见异物检查中，要求应无肉眼可见异物，但在一些特殊单抗制品中，由于其某些特征，如分子表面有大量疏水基团或有游综述China Licensed PharmacistＪａｎ．２０１３，Ｖｏｌ．１０Ｎｏ．１合理用药呵护公众健康表1单抗质量控制项目及要求注：ＢＣＡ法：二辛可酸法；ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：分子尺寸排阻高效液相色谱法；ＥＬＩＳＡ法：酶联免疫吸附法；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；ＣＥ－ＳＤＳ：十二烷基硫酸钠-毛细管电泳；ＩＥＣ－ＨＰＬＣ：离子交换-高效液相色谱法；ＣＩＥＦ：毛细管等电聚焦电泳；Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法：蛋白印迹法；ＰＣＲ：聚合酶链反应；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法：阈值法；ａ：可对非还原法电泳中的蛋白纯度进行相应规定；ｂ：可对样品电泳条带的等电点（ｐＩ）范围进行相应规定，在ＣＩＥＦ检测中，可对各峰面积百分比进行相应规定；ｃ：需根据方法的精确性和临床试验结果制定检测大类检测项目检测方法质量标准制定参考外观肉眼观察根据制品情况，制品的外观应符合要求，不得有污染和破损颜色在限定光强度条件下肉眼观察根据制品的具体情况，为澄清或具有轻微乳光的无色或淡黄色（≤特定参比溶液）液体（冻干制剂应复溶）浊度浊度计检测根据制品的具体情况应符合要求（≤特定参比溶液）理化检测复溶时间（仅冻干制剂）人工测定符合相应规定装量体积测定不少于标示装量装量差异称重法符合相应规定水分（仅冻干制剂）费休氏测定法不高于３．０％ｐＨ电位法在规定范围内渗透压冰点降低法在规定范围内不溶性微粒光阻法注射剂：≥１０μｍ微粒每瓶不得超过６０００个；≥２５μｍ微粒每瓶不得超过６００个；眼用制剂：≥１０μｍ微粒每瓶不得超过５０个；≥２５μｍ微粒每瓶不得超过５个滴定法（Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法等）测定结果应位于规定范围内ＳＥＣ－ＨＰＬＣ测定结果应位于规定范围内ＳＥＣ－ＨＰＬＣ单体含量不少于９５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（还原法）重链＋轻链含量不少于９５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（非还原法）同参比品一致ａＣＥ－ＳＤＳ（还原法）产品峰总面积≥９０％ＣＥ－ＳＤＳ（非还原法）电泳图谱同参比品一致ａ等电点测定等电聚焦电泳同参比品一致ｂＣＩＥＦ同参比品一致ｂ毛细管区带电泳毛细管区带电泳法电泳图谱同参比品一致，且样品主峰迁移时间应位于规定范围内ＩＥＣ－ＨＰＬＣＩＥＣ－ＨＰＬＣ酸性区、主峰、碱性区峰面积百分比位于规定范围内肽图胰蛋白酶等肽图法阳性（同参考图谱比较，有所有／部分特定色谱峰，且无明显新峰）Ｎ-末端氨基酸序列测定Ｅｄｍａｎ降解法同理论序列一致免疫学鉴别ＥＬＩＳＡ法阳性Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法阳性ＥＬＩＳＡ法、流式细胞术法、表面等离子共振法、Ｂｉａｃｏｒｅ等对参比品的相对活性在规定范围内ｃ无菌膜过滤法／培养法无菌生长热原动物实验符合相应规定内毒素鲎试剂测定符合相应规定宿主细胞蛋白残留ＥＬＩＳＡ法≤０．０１％蛋白Ａ残留ＥＬＩＳＡ法≤０．０１％宿主细胞ＤＮＡ残留杂交法符合相应规定荧光定量ＰＣＲ法［６］符合相应规定Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法［７］符合相应规定其他添加因子（如：牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、胆固醇和其他的培养基内特殊添加物质等）相应测定方法符合相应规定异常毒性、Ｔｗｅｅｎ－８０、唾液酸含量等相应测定方法符合相应规定结合活性一般检查鉴别活性安全性纯度蛋白纯度可见异物肉眼观察无肉眼可见异物分光光度法测定结果应位于规定范围内含量蛋白含量ＥＬＩＳＡ法测定结果应位于规定范围内ＩＥＣ－ＨＰＬＣ法酸性区、主峰、碱性区峰面积百分比位于规定范围内双向免疫扩散法符合规定种属鉴别生物学活性特定的生物学活性测定法对参比品的相对活性在规定范围内ｃ中国执业药师·离的半胱氨酸等，使其可能会形成肉眼可见的蛋白颗粒，这些制品使用时多采用在线滤器过滤的方式除去蛋白颗粒，在充分阐明颗粒性质和有具体临床研究资料的情况下，这类制品的可见异物项目检查中可以容许有肉眼可见的颗粒样物质。