EST或转录组分析
转录组分析流程范文
转录组分析流程范文转录组分析是一种用于研究特定生物体或组织中的全部转录本的方法。
它通过测量RNA分子在特定时间点和条件下的表达水平，揭示了基因转录的调控机制，功能注释和转录本的表达图谱，并为找到新的基因和功能注释提供了线索。
下面是一个常用的转录组分析流程，包含预处理、质控、序列比对、表达定量和差异分析等步骤。
1.数据预处理：数据预处理主要包括质量控制和去除低质量序列。
在高通量测序中，原始的测序数据通常包含低质量碱基、接头序列和多聚A/T等噪声。
质控工具如FastQC可以用于评估测序数据的质量，根据其结果，采用切割、修剪、过滤和去除低质量序列来提高数据质量。
2.序列比对：序列比对是将预处理后的测序数据与参考基因组进行比对的过程。
常用的比对工具包括Bowtie、BWA和STAR等。
这一步的目的是将测序数据映射到参考基因组上，以确定每个读取序列的起始位置。
3.表达定量：表达定量是将比对得到的序列转化为表达量的过程，它衡量了每个转录本的相对丰度。
常用的表达定量工具包括HTSeq、Cufflinks和Salmon 等。
这些工具通过计算每个转录本对应的读取数来估计其表达水平，并生成基因表达矩阵。
4.差异表达分析：差异表达分析是比较不同条件下的基因表达量，以确定哪些基因在不同条件下的表达水平发生了显著变化。
常用的差异表达分析工具包括DESeq2、edgeR和limma等。
这些工具通过统计学方法来鉴定不同条件之间的显著差异，并生成差异表达基因列表。
5.功能注释：功能注释是对差异表达基因进行生物学功能注释的过程。
常用的功能注释工具包括DAVID、GOseq和KEGG等。
这些工具通过富集分析、与已知数据库的比对和基因网络分析等方法，帮助研究人员了解差异表达基因的功能和参与的生物学过程。
6.结果可视化：结果可视化是将转录组分析结果以图形化的形式呈现，以帮助研究人员理解和解释数据。
常见的结果可视化工具包括Heatmap、Venn图、火山图和基因网络图等。
转录组分析_R
• 基因功能注释 • 基因结构分析 • 鉴定出大量新转录本 • 可变剪接鉴定 • 基因融合鉴定
Genome Res 2010
无参考基因组生物信息分析
• Unigene功能注释 • Unigene的GO分类 • Unigene代谢通路分析 • 预测编码蛋白框（CDS） • Unigene表达差异分析 • Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化 • 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
有参考基因组序列信息分析流程
Reads 在基因组上的分布
基因结构优化
通过转录组测序鉴定出酵母3’ 和5’ UTR区域 (Nagalakshmi, U. et al.,2008)
富集性分析
De novo reads组装流程
Unigene GO 分类
Unigene COG 功能分类
基因表达差异分析
N1:total tag Number in sample A N2:total tag Number in sample B X :Gene expression level in sample A y :Gene expression level in sample B Reference: Audic S. et al. The significance of
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTC GGC AC AG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
水产动物基因转录组学研究进展
水产动物基因转录组学研究进展摘要：我国作为最大的发展中国家和传统的农业大国，农业有着巨大的应用空间和广阔的发展前景。
而在农业中，水产方面又是一大类重要的发展方面。
近年来，水厂养殖相关技术不断更新发展，我国的水产行业发展水平日新月异，而在相关研究中，分子生物学与水产的结合吸引了更多人的目光。
本文将就分子生物学与水产养殖的结合进行综述，主要方面为外界环境条件改变、饲料营养成分改变对基因表达的影响以及转录组学技术在水产动物研究中的应用。
关键词：水产养殖；分子生物；基因表达；转录组学1 基因转录组学在水产动物研究中的应用近年来，转录组学技术及其在水产动物中的研究备受研究者的广泛关注。
转录组学技术主要有基于杂交技术和测序技术为基础的两大类技术; 两类技术在水产动物的转录组学研究中均得到了广泛运用。
以下就近年来水产动物在免疫应答、生长发育、生物进化和毒理学方面的转录组学研究进展进行整理。
转录组学、基因组学和蛋白质组学等各种组学技术在揭示水产动物抗病免疫、生长发育、系统进化和生物毒理过程及相应机理方面的研究中越来越重要。
通过组学研究，可以深刻理解水产动物各种生命活动规律的内在联系和分子机制，并根据相应结果进一步运用到抗病育种、药物筛选、种质资源保护和环境监测等多个研究领域。
转录组学是研究特定细胞、组织或器官在特定生长发育阶段或某种生理状况下所有转录本的科学。
这所有的转录本就称之为转录组，包括编码蛋白质的mRNA和非编码RNA( rRNA，tRNA和其他ncRNA)。
与基因组相对稳定不同的是，转录组是随着生长发育阶段、生理状态和外界环境的改变而变化的。
因此，转录组分析成为研究生物生长发育、应激生理、抗病免疫等作用机制的有力工具。
依据转录组学技术原理的不同，可以将其划分为两类技术，一种是基于杂交的转录组学技术，如利用cDNA微阵列(cDNA microarray) 和DNA宏阵列( DNA macroarray) 进行检测的转录组学技术; 一种是基于测序的转录组学技术，如cDNA 文库或表达序列标签( expressed sequence tags，EST) 文库测序技术，基因表达系列分析( serial analysis of gene expression，SAGE) 技术和大规模平行测序( massively parallel signature sequencing，MPSS) 技术，以及近年来发展起来的下一代高通量测序技术( next generation sequencing，NGS) ，即RNA测序( RNA sequencing，RNA-seq) 技术等。
EST介绍
表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。
这一概念首次由Adams等于1991年提出。
近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。
在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。
克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。
而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。
文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。
1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。
因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。
Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。
虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。
Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。
基于转录组测序的油梨EST-SSR引物开发
基于转录组测序的油梨EST-SSR引物开发应东山;唐浩;韩瑞玺;王文林;王明;王琴飞;汤秀华;张如莲【摘要】利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列(EST-SSRs),为SSR标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础.采用Illumina二代测序的技术,共获得37639条无冗余的序列,对其进行SSR搜索,共获得6419条简单序列重复(SSR).利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并以11份油梨种质筛选多态性引物.基于转录组序列开发出的EST-SSR的分布频率为17.05％.在油梨EST-SSR中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的99.07％.单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的37.47％、31.80％和29.80％;出现频率最高的二核苷酸重复基元是AG/CT,占总数的29.15％,出现最高的三核苷酸重复基元为AAG/CTT,占12.01％.随机选择315个SSR位点合成引物,经11份油梨种质筛选鉴定,227对引物可扩增获得产物,有效扩增率为72.06％;其中34对引物表现出良好多态性,占有效引物的12.78％,占总引物的10.79％.在34对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数2～12个.利用高通量测序开发SSR引物有较好的实用性,开发获得的34个具有多态性的油梨SSR标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2018(039)012【总页数】6页(P2446-2451)【关键词】油梨;转录组;EST-SSR;引物【作者】应东山;唐浩;韩瑞玺;王文林;王明;王琴飞;汤秀华;张如莲【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101;农业农村部科技发展中心,北京 100122;农业农村部科技发展中心,北京 100122;广西南亚热带农业科学研究所,广西龙州 532415;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口571101;广西南亚热带农业科学研究所,广西龙州 532415;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室/农业农村部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心,海南海口 571101【正文语种】中文【中图分类】S31油梨（2n=24，Persea americana Mill.）是樟科（Lauraceae）油梨属常绿乔木果树，富含脂肪、热能高，故有“森林黄油”之美称，是重要的热带果树之一。
转录组的研究技术方法及当前
RNA-seq的特点及应用
• 二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先前的基因芯片 (microarrays)和基因表 达系列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全 面地揭示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情况, 如 发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核苷酸的多态(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性变异(structural variation)。对于 序列信息有 限的非模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于基因组, 重 复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容易, 所以转录组研究在许 多非模 式植物中得到了广泛应用。
研究转录组的基本方法
• 目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术，如cDNA芯片和寡聚核苷 酸芯片；（2）基于测序技术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel SignaturEST等的测序 工作已升级为代测序技术，第一代测序技术较Sanger测序技术通量更高，运 行时间更短，测序片段更长；（3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序， 现在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称为RNA-பைடு நூலகம்eq。
(4）高通量测序技术的特点
SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高通量模式。作为蛋白质组研究 的基础，RNA-seq可以识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学家构 建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。RNA-seq对于真核生物的基因表 达调控，癌症等疾病的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研究具有 不可估量的潜力。
转录组数据分析解读及实例操作-1
Content of transcriptome
1. Genes: expression , alterante splices 2. Noncoding RNA: snoRNA, mRNA-like ncRNA, snRNA, some antisense transcripts, pesudogenes, retrotransposon ,and others functional RNAs 3. Some repeat elements
用于注释基因组的转录组大于100m最好有浓度不同长度不同的绝对定量controlspikein以评估mapping质量测序均匀性和rnaseq定量效果3端5端比值是衡量rna完整性的关键指关标准
1. 至少有两个生物学重复，除非“短时间梯度取样” (overlapping time points with high temporal resolution)不需要 技术重复 2. 对基因注释较好的物种，只定量比较研究，可用reads大于 20M；用于注释基因组的转录组，大于>100M 3. 最好有浓度不同长度不同的绝对定量control (Spike-in)，以评 估mapping质量、测序均匀性和RNA-seq定量效果 4. “3端/5端比值”是衡量RNA完整性的关键指标(理想值是1)，，样品评估关键指标，rpkm值关键结果完备。
转录组数据分析解读及 实例操作
罗奇斌 中科院基因组研究所 德国慕尼黑工业大学
Second genera+on sequencers
2
3
4
常规分析
5
实验流程
6
分析所需工具
• Bow+e so1ware • SAM tools
转录组测序技术的应用及发展综述
转录组测序技术的应用及发展综述摘要：转录组测序（RNA-Seq）作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。
RNA—Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA 反转录而成cDNA文库进行测序，通过统计相关读段（reads）数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本;如果有基因组参考序列,可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。
文章主要比较近年来转录组研究的几种方法和几种RNA—Seq的研究平台，着重介绍RNA—Seq 的原理、用途、步骤和生物信息学分析，并就RNA—Seq技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论及在相关领域的应用等内容，为今后该技术的研究与应用提供参考。
关键词: RNA-Seq；原理应用；方法;挑战；发展前景Abstract：Transcriptome sequencing （RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome。
RNA—Seq to use high-throughput sequencing of tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced, through statistical correlation read paragraph (reads）numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence，the transcripts mapped to genomic, determine the position of the transcription shear condition, more genetic information，has been widely used in biological research，medical research，clinical research and drug development。
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Different expression test
Pathway mapping
俞鸿 yuhong19790308@
RNA-seq数据分析
29 俞鸿 yuhong19790308@
俞鸿 yuhong19790308@
数据库相似性检索
俞鸿 yuhong19790308@
EST翻译与ORF预测
俞鸿 yuhong19790308@
功能注释与功能分类
序列相似性比对
BLAST，BLAT NR，UniRef100，Genome sequences，etc.
俞鸿 yuhong19790308@
SNP分析软件
The GS Reference Mapper(454 Life Science) Pyrobayrs
俞鸿 yuhong19790308@
应用实R例oche 454转录组数据分析
Next-generation pyrosequencing of gonad transcriptomes in the polyploid lake sturgeon (Acipenser fulvescens): the relative merits of normalization and rarefaction in gene discovery. Hale MC, McCormick CR, Jackson JR, Dewoody JA. BMC Genomics. 2009 Apr 29;10:203. PMID: 19402907 [PubMed - indexed for MEDLINE]
俞鸿 yuhong19790308@
Map reads onto genomes (Bowtie)
Nat Biotechnol. 2009,27(5):455
Genome Biology 2009, 10:R25
俞鸿 yuhong19790308@
Map reads onto junctions (Tophat)
0.89
MADS
0.06% 0.00% 0.06% 0.34% 0.00% 0.13% 0.10% 0.40% 0.10% 0.13% 0.14%
1.08
Gene identification and expression analysis of 86,136 Expressed Sequence Tags (EST) from the rice genome PMID: 15626331
Domain与motif查找
Interproscan, pfam
GO功能分类与富集Biblioteka 析BLAST2GO, etc.
俞鸿 yuhong19790308@
EST ANALYSIS PIPELINES
俞鸿 yuhong19790308@
SNP分析
基本统计信息
工具
RepeatMasker MaskerAid
去除污染序列
BLAST
Library Lib 1 Lib 2 Lib 3 Lib 4 Lib 5 Lib 6 Lib 7 Lib 8 Lib 9 Mean
STDEV STDEV/Mean
rRNA 0.25% 0.66% 1.99% 0.09% 0.64% 0.40% 0.20% 0.18% 0.35% 0.53% 0.58%
including its non-coding regions; • βN,which estimates the diversity in non-synonymous sites; • βS, which estimates the diversity in synonymous sites.
SNP number SNP出现频率
Non-synonymous and synonymous 其他统计信息
non-
俞鸿 yuhong19790308@
Nucleotide diversity analysis
S is the number of SNPs detected in the contig, L is the contig sequence length and D is the sequencing depth β is useful as a relative measurement to compare the nucleotide diversity between contigs generated within this project. Coding sequence measuring more than 200 bp and an average sequencing depth of at least 10 reads/nt. Three β parameters were calculated for each contig: • βT, which estimates the diversity on the entire contigs,EST/cDNA数据分析开放共赢 关注创新
俞鸿
副总经理
手机：15900766827 E-mail: hyu@
12628609@
1
什么是ESTs？
ESTs（Expressed Sequence tags ）是从cDNA文件中随机挑 选单次测序的短序列，提供了全基因组测序的廉价替代方案 。
序列前处理
载体序列屏蔽
无冗余载体序列库
UniVec EMVEC
工具
BLAST Cross_Match
低复杂性区域查找与屏蔽
DUST
重复因素
类型
LINEs(Long interspersed elements) SINEs(Short interspersed elements) LTRs(Long terminal repeat) SSRs(Short simple repeats)
含有同一基因不同的转录形 式，如各种选择性剪接体
每一类中可能包含旁系同源 基因(paralogous expressed gene)的转录本
序列的保真度低
Unigene的聚类方法位于两者之间
stackPACK
聚类与拼接软件
俞鸿 yuhong19790308@
结果统计
Assembies/contigs and singletons number Total length Length distribution Contig depth statistics
俞鸿 yuhong19790308@
Xenobiotics
Best BLAST hit an e-value ≤ 1 × 10-03 and a bit score > 40 was considered a significant match
俞鸿 yuhong19790308@
表达谱分析 交替剪接分析 SSR分析
ESTSeq 2000, SoLid,3730， …
俞鸿 yuh物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克鸿 yuhong19790308@
传统测序转录组测序结果分析
8 俞鸿 yuhong19790308@
ESTs数据质量
Phred scores
q=20, 99% base calling accuracy
俞鸿 yuhong19790308@
Read summary statistics
5 Libraries
Normalized libraries 1-2 Native libraries 3-5
俞鸿 yuhong19790308@
Contig summary
PCAP, not Newbler assembler
Mitoc hondria mRNA 4.90% 0.78% 0.18% 0.31% 0.65% 0.22% 0.30% 0.31% 0.31% 0.88% 1.52%
G3PD 0.56% 0.71% 0.50% 0.78% 0.76% 0.44% 0.55% 0.92% 0.78% 0.67% 0.16%
已
单向测序 双向测序
俞鸿 yuhong19790308@
ESTs测序
传统Sanger测序方法
3730
二代测序
Roche / 454 Genome Sequencer FLX
俞鸿 yuhong19790308@
ESTs的用途
基因查找 补充基因组 表达量比较分析 辅助基因结构的鉴定 交替剪接的分析 SNP分析 蛋白质组学质谱搜库
俞鸿 yuhong19790308@数据库匹配 功能注释 其它分析
fragments mapped
FPKM t
=
Xt Lt M
×109
every 5.2 reads (on average) resulted in a different significant BLAST hit.
俞鸿 yuhong19790308@
Workflow
Data format conversion
Map reads onto the genome (8-10h/sample)
Gene Ontologies
BLAST2GO
俞鸿 yuhong19790308@
SNP detection
877 candidate SNPs
~1SNP/460bp one in every 192 bp in Eucalypt
Indel-type errors Classification statistics
0.24
Ac tin 0.29% 0.20% 0.36% 0.76% 0.50% 0.66% 0.59% 0.62% 0.17% 0.46% 0.21%