超氧阴离子清除实验
超氧阴离子清除能力邻苯三酚法
超氧阴离子清除能力邻苯三酚法1 超氧阴离子的来源超氧阴离子(O2•-)是一种高活性自由基，是氧气分子失去一个电子后产生的。
在生物体内，超氧阴离子通常由线粒体电子传递链产生，同时也可以由细胞质中的NADPH氧化酶生成。
2 超氧阴离子的损害超氧阴离子是一种极其活泼的氧化剂，可以与细胞内的脂质、蛋白质和核酸等大分子发生氧化反应，并引起细胞的损害。
长期以来，科学家们一直在研究如何有效地清除超氧阴离子，以保护细胞免受其损害。
3 邻苯三酚法的原理邻苯三酚法是一种用于清除超氧阴离子的方法，该方法利用邻苯三酚的还原能力，将超氧阴离子还原成氧气分子，以达到清除超氧阴离子的目的。
邻苯三酚法的原理如下：① 邻苯三酚在氧气存在下被氧化成半醌，1C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O2 →C6H5-1C(O)2-2C6H4+H2O2② 半醌进一步被氧化成互相联结的二聚体，1C6H5-1C(O)2-2C6H4+C6H5-1C(O)2-2C6H4→(C6H5-1C(O)2-2C6H4)22③ 该反应同时产生超氧阴离子，1O2 +e-→O2•-2导致增加超氧阴离子的浓度。
④ 当邻苯三酚浓度超过一定程度时，它具有还原能力，可以将超氧阴离子还原为氧气分子，1O2•- + 2C6H5-1C(O)2-2C6H4→2C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O24 邻苯三酚法的应用邻苯三酚法已被广泛用于生物学、医学和环境科学等领域。
在生物学中，这种方法被用于研究超氧阴离子在细胞中的作用。
在医学中，邻苯三酚法被应用于治疗一些慢性气道疾病，如支气管哮喘。
在环境科学中，邻苯三酚法也被用于去除环境中的有害物质，如重金属离子。
5 邻苯三酚法的不足虽然邻苯三酚法是一种有效清除超氧阴离子的方法，但它也存在一些不足之处。
一方面，邻苯三酚的使用受到其毒性和生物可降解性的限制；另一方面，邻苯三酚的还原能力相对较弱，反应速度较慢，因此需要较长时间来消除超氧阴离子。
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。
·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。
高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。
NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。
清除超氧阴离子自由基
清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。
每个试样作三个平行样，取其平均值。
实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。
注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。
2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。
考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。
清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。
中药对超氧阴离子自由基清除率的测定
第１ 期
林祥 潮等 ：中药对 超氧 阴 离子 自由基 清 除率 的测 定
３ ３
在表 ｌ 示 的光度 法 中，羟 胺氧 化法 由于 甲萘 胺溶 液不 稳定 ，因而 线性相 关性较 差 ；氯 所 化硝 基 四氮 唑蓝还 原法 和 四 甲基 偶氮 唑盐还 原法 都 需要 昂贵 的氮 唑类 化合 物 ； 照核黄 素法 光 中硫 代碳 酰腙 类化 合物 需要 合成 ；酶催 化法 需要 昂贵 的酶试 剂且 测定 条件 苛刻 ；而本 方法 只 需 用天 青 Ｉ 为指 示物 质 ，指示 反应简 单直 接 ，且指 示物质 易得 价廉 ，体 系稳 定性好 ，能快 作
液后 ， 向其 中一 支加 入 ０８ ０ｍｍｏ Ｌ的邻 苯三 酚溶 液 ，另一支 不加 。分 别用水 稀释 至 ．０ ３ ｍＬ ｌ ／
刻度 ，在 室温 下反应 １ ｎ ５ ｍｉ，以水 为参 比，用 １ ｍ 比色皿在 ６ ２ ｌ 波长 处测 定体 系 的吸光 ｃ ０ Ｙ ｎｌ
度 。设不加 邻苯 三酚 时体 系 的吸光度 为 ｏ ，加 入邻 苯三 酚后 体系 的吸光 度 为 １ ，则超氧 自
超氧 阴离 子 自由基 （ ２・ ０ 。）作 为生物 体所产 生 的一种 自由基 ，大 量研 究证 明 ， 自由基 的
作用 与 生物 衰老 、某些 疾病 的发病 机制 密切相 关 。关 于它 的清 除方法 ，光度 测 定 已有 一些报 道 【 ］ 以天青 Ｉ为指示 物质 ，褪 色光 度法 测定 中药 清 除超氧 阴 离子 自由基 未见 报 道 。本 １ ，但 文研 究发现 ，在一 定条 件下 ，天 青 Ｉ 能被超 氧 阴离子 自由基氧 化而褪 色 ，中药提 取物 可 以清
度值 记为 ２ 。 超氧 自由基清 除率 Ｒ ％ ： 二 × ０ ／ １０ ４
超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书 可见分光光度法
第1页，共2页超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC1410规格:50T/48S 产品内容:提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加8mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
产品说明:超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。
AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO 2－，NO 2－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。
自备实验用品及仪器:天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅。
操作步骤:一、样品处理1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3.培养液或其它液体：直接检测。
4.粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。
二、测定操作空白管对照管测定管试剂一（μL）404040试剂二（μL）160160H2O（μL）260100充分混匀，25℃反应1min样品（μL）100试剂三（μL）200200200充分混匀，37℃反应30min试剂四（μL）200200200试剂五（μL）200200200充分混匀，37℃显色20min，于1ml玻璃比色皿，以空白管调零，在530nm处测定对照管和测定管的吸光值，分别记为A对照管和A测定管。
牛磺酸清除超氧阴离子和羟自由基的实验研究
２ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｔ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ｆＰ ｏ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ Ｆ ｏ ｕ ｒ ｔ ｈ Ｐ ｅ ｐｌ ｏ ｅ ＆Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ８ ０ ３ ３ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
Ｚ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ Ｊ ｉ ａ —ｊ ｉ ａ ，ＵＮ Ｙ ｉ ｎ ｇ ，Ｚ Ｅ Ｎ Ｇ Ｆ ａ ｎ—ｔ ａ ｏ
（ １ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＰ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｙ ，Ｔ ｈ ｅ Ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ Ｐ ｅ ｏ ｐ ｌ ｅ ｓ ＇ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＬ ｏ ｎ ｇ ｇ ａ ｎ ｇ Ｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ８ １ １ ２ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
ｉ ｄ ｅ ａ ｎ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｏ ｆ ｔ ａ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅ’ ｓ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｃ ａ ｖ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｘ ｙ ｌ ｒ ａ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｔ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｈｅ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｎ ｔ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ
Ｅｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ Ｔａ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅ Ｃｌ ｅ ａ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｏ ｘ ｉ ｄ ｅ Ａｎ ｉ ｏ ｎ Ｒａ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｈｙ ｄ ｒ ｏ ｘ ｙ ｌ Ｆ ｒ ｅ ｅ Ｒａ ｉｃ ｄ ａ ｌ
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芦荟中芦荟苷清除超氧阴离子自由基的ESR研究_陈丹
组别
动物数 (只 )
剂量 ( g /kg)
SOD 活力 ( U / L)
CAT 活力 ( @ 10- 4 )
G SH-PX 活力 ( U /L)
空白对照组
10
2032 ? 6912)
2. 962 ? 0. 4012)
13. 1 ? 3. 52)
模型组
10
962 ? 493
1. 713 ? 0. 401
7 9. 1 ? 2. 6
香菇多糖组
10
莲子多糖组
10
莲子多糖组
10
0. 1
1434 ? 5272)
3. 040 ? 0. 5572)
12. 5 ? 2. 91)Fra bibliotek0. 2
1822 ? 7682)
3. 476 ? 0. 7642)
13. 7 ? 3. 52)
0. 4
1685 ? 7442)
2. 885 ? 0. 5532)
剂量 ( g /kg)
血浆 LPO 水平
脑匀浆 LPO 水平
肝匀浆 LPO 水平
空白对照组
10
0. 151 ? 0. 0432)
0. 199 ? 0. 0332)
0. 158 ? 0. 0281)
模型组
10
0. 276 ? 0. 062
0. 412 ? 0. 085
0. 199 ? 0. 048
香菇多糖组
13. 9 ? 2. 02)
注: 与模型组相比 1) P < 0. 05, 2) P < 0. 01
N ote: 1) P < 0. 05, 2) P < 0. 01vs the m odel group 3. 2 芦 笋 多糖 对 衰 老模 型 小鼠 血 浆、肝 匀 浆和 脑 匀浆 中 模型成功。与模 型组比, 大、小 剂量莲 子多 糖组均 可显 著降 LPO 水平的影响模型组血浆、脑匀浆及肝匀浆 LPO 水平均明 低血浆及脑匀浆 LPO 水平 (P < 0. 01) , 小 剂量组明显 降低肝 显或显著高于空白对 照组 (P < 0. 05, P < 0. 01), 说明 造衰老 匀浆 LPO 水 平 (P < 0. 05)。见表 2 表 2 莲子多糖对衰老模型小鼠血浆、脑匀浆、肝匀浆中 LPO 水平的影响 ( x¸? s)
超氧阴离子自由基清除
一．实验原理：该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。
通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。
二．实验仪器：分光光度计三．实验试剂：一：液体40mL×1瓶；二：液体1mL一瓶；三：粉剂一支；四：粉剂一支；五：1mg/mL芦丁标准品，1mL四．溶液配制：一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液；二工作液：用赠送的棕色瓶配制。
试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光；三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用；四工作液：粉剂一支。
用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。
注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。
五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。
五．实验步骤：充分混匀，室温避光静置5min使之充分反应。
560nm处，1cm光径比色杯，采用分光光度计测定吸光值。
六．清除能力计算：超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0；2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。
七．注意事项：1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
3. 试剂三建议全程冰上操作。
试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。
建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。
试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。
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·O2ˉ自由基清除实验
(1) 实验原理
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯
即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。
·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂
Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)
实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用
Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)
0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)
NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,
黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)
实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用
PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,
800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。
高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上
Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度
实际配制见记录本！
HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)
实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。
NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱
(3) 测定方法
超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。
样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。
Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
LWT, 40:955-962.
A）在96孔板孔中依次加入100μL 黄嘌呤(0.4mmol/l)和NBT(0.24mmol/l)的混合液(每种各50μL，溶于0.01mol/l的PBS，pH=8.0)，100μL黄嘌呤氧化酶(0.049units/ml), 50μL 样品溶液
B）混匀后37℃孵育30min, 酶标仪测OD560值(扣除OD800值)。
不加样品溶液作为空白对照，Vc(维生素C)为阳性对照，每个浓度的样品平行测定三次，分别计算清除率及样品的IC50。
IC50的计算，运用NDST 软件包进行。
(4) 样品清除率=（OD空白-OD样品）/OD空白×100%.
PS：某些样品在水中溶解度不好的可在聚四氟乙烯管内水浴孵育，再取反应液到96孔板中测试。
所加反应试剂按比例增加。
所有。