超氧阴离子清除实验
清除超氧阴离子自由基
清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。
每个试样作三个平行样，取其平均值。
实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。
注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。
2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。
考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。
清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。
中药对超氧阴离子自由基清除率的测定
第１ 期
林祥 潮等 ：中药对 超氧 阴 离子 自由基 清 除率 的测 定
３ ３
在表 ｌ 示 的光度 法 中，羟 胺氧 化法 由于 甲萘 胺溶 液不 稳定 ，因而 线性相 关性较 差 ；氯 所 化硝 基 四氮 唑蓝还 原法 和 四 甲基 偶氮 唑盐还 原法 都 需要 昂贵 的氮 唑类 化合 物 ； 照核黄 素法 光 中硫 代碳 酰腙 类化 合物 需要 合成 ；酶催 化法 需要 昂贵 的酶试 剂且 测定 条件 苛刻 ；而本 方法 只 需 用天 青 Ｉ 为指 示物 质 ，指示 反应简 单直 接 ，且指 示物质 易得 价廉 ，体 系稳 定性好 ，能快 作
液后 ， 向其 中一 支加 入 ０８ ０ｍｍｏ Ｌ的邻 苯三 酚溶 液 ，另一支 不加 。分 别用水 稀释 至 ．０ ３ ｍＬ ｌ ／
刻度 ，在 室温 下反应 １ ｎ ５ ｍｉ，以水 为参 比，用 １ ｍ 比色皿在 ６ ２ ｌ 波长 处测 定体 系 的吸光 ｃ ０ Ｙ ｎｌ
度 。设不加 邻苯 三酚 时体 系 的吸光度 为 ｏ ，加 入邻 苯三 酚后 体系 的吸光 度 为 １ ，则超氧 自
超氧 阴离 子 自由基 （ ２・ ０ 。）作 为生物 体所产 生 的一种 自由基 ，大 量研 究证 明 ， 自由基 的
作用 与 生物 衰老 、某些 疾病 的发病 机制 密切相 关 。关 于它 的清 除方法 ，光度 测 定 已有 一些报 道 【 ］ 以天青 Ｉ为指示 物质 ，褪 色光 度法 测定 中药 清 除超氧 阴 离子 自由基 未见 报 道 。本 １ ，但 文研 究发现 ，在一 定条 件下 ，天 青 Ｉ 能被超 氧 阴离子 自由基氧 化而褪 色 ，中药提 取物 可 以清
度值 记为 ２ 。 超氧 自由基清 除率 Ｒ ％ ： 二 × ０ ／ １０ ４
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
牛磺酸清除超氧阴离子和羟自由基的实验研究
２ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｔ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ｆＰ ｏ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ Ｆ ｏ ｕ ｒ ｔ ｈ Ｐ ｅ ｐｌ ｏ ｅ ＆Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ８ ０ ３ ３ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
Ｚ Ｈ Ｅ Ｎ Ｇ Ｊ ｉ ａ —ｊ ｉ ａ ，ＵＮ Ｙ ｉ ｎ ｇ ，Ｚ Ｅ Ｎ Ｇ Ｆ ａ ｎ—ｔ ａ ｏ
（ １ ． Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＰ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｙ ，Ｔ ｈ ｅ Ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ Ｐ ｅ ｏ ｐ ｌ ｅ ｓ ＇ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＬ ｏ ｎ ｇ ｇ ａ ｎ ｇ Ｄ ｉ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ，Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ８ １ １ ２ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
ｉ ｄ ｅ ａ ｎ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｏ ｆ ｔ ａ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅ’ ｓ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｃ ａ ｖ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｘ ｙ ｌ ｒ ａ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｔ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｈｅ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｎ ｔ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ
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ｔ ａ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ：Ｅ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｔ ａ ｕ ｉ ｒ ｎ ｅ ｏ ｎ ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｏ ｘ ｉ ｄ ｅ ａ ｎ ｉ ｏ ｎ ｒ ａ ｄ ｉ ｃ ｌ ａ ａ ｎ ｄ ｈ ｙ ｄ ｍｘ ｙ ｌ ｒ ａ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｃ ａ ｖ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｇ ｉ ｓ ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ， ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｗｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ａ ｄ ｄ ｅ ｄ ａ ｍｏ ｕ ｎ ｔ ｏ ｆ ｔ ａ ｕ ｉ ｒ ｎ ｅ ｉ ｎ ａ ｃ ｅ ｒ ｔ ａ ｉ ｎ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ． Ｃｏ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ ：Ｔ ｈ ｅ ｂｉ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｔ ａ ｕ ｒ ｉ ｎ ｅ’ Ｓ ａ ｎ ｔ ｉ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｎ ｔ ｉ ｓ
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化能力分析方法
超氧阴离子（O2-·）清除能力的测定
采用邻苯三酚自氧化法，略有修改。
25℃恒温条件下，在10mL容量瓶中依次加入pH为8.3的0.05mol/L Tris-HCl 溶液5.0mL，加不同浓度的样品液0.5mL，加入蒸馏水3.3mL，加入2mmol/L邻苯三酚0.2mL，总体积共9mL。
以二次蒸馏水作对照，邻苯三酚最后加入，迅速混匀后，测定A322，每隔1min测一次，直到反应后第5min，求斜率V。
VC和BHA做样品对照。
清除率K(%)=（V s-V）/V s×100%
式中：Vs——0.5mL蒸馏水与反应体系反应的速率
V——0.5mL样品液与反应体系反应的速率
羟基自由基（·OH）清除能力的测定
本实验采用羟基自由基试剂盒的方法测定。
原理：Fenton反应是最常见的产生羟基自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton产生的.OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与.OH的多少成正比关系。
抑制率K1(%)=（OD1-OD2）/ OD1×100%
式中：OD1——对照管吸光度
OD2——样品管吸光度。
清除超氧阴离子能
2.3试验方法
吸取不同质量浓度样品液1mL 于试管中，依次加 入1mL 0.078mol/LNBT，1mL 0.468mol/L NADH， 最后加入0.4mL 的0.06mol/L PMS 溶液，室温摇 匀，后静置5min，于560nm波长处测定吸光度， 调零组用不同质量浓度样品液1mL，0.4mL 蒸馏 水代替PMS 溶液调零，用蒸馏水作阴性对照，VC 作阳性对照，清除率计算
1.2试剂
Tris-HCl 缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷） 邻苯三酚 HCl 溶液
1.3仪器
紫外-可见分光光度计 真空干燥箱 电热恒温水浴锅 旋转蒸发仪
1.4试验方法：
【1】取4.5 mL 50mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液（pH 8.2）， 4.2 mL 蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出， 立即加入在25 ℃预热的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL，迅速 摇匀后倒入比色杯， 于325 nm 处每隔30 s 测定吸光度， 计算线性范围内每分钟内吸光度的增加值， 以10mmol/L HCl 溶液配制空白为对照。 加入晒青毛茶不同溶剂提取物后， 邻苯三酚自氧化速率 的测定方法：按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加 入0.1 mL 不同浓度的样品液，蒸馏水减少。同样以10 mmol/L HCl 溶液配制空白管并作为对照。计算清除超氧 阴离子清除率。清除率:
【2】邻苯三酚自氧化法测定按参照文献[11]的方 法并略有改动，按照表3进行加样，在325 nm波长 下，每隔0.5 min记录一次值，连续记录3 min。样 品在同样条件下测定吸光值，每个处理试样均做3 个平行试验，取平均值。多糖对超氧阴离子的清除 作用按下列公式计算：
超氧阴离子自由基清除实验
超氧阴离子自由基清除实验
超氧阴离子自由基清除实验是一种用于测量超氧阴离子自由基（O2-）在发射光谱中的吸收程度的实验方法。
该实验需要设备有发射光谱仪、恒
定光源和荧光检测器。
实验步骤如下：1、将要测量的样品置于发射光谱
仪中，并调节恒定光源；2、将荧光检测器置于样品前，并开启荧光检测器；3、使用发射光谱仪测量样品发射光谱；4、计算发射光谱的吸收程度；
5、根据发射光谱的吸收程度和超氧阴离子自由基（O2-）的濃度，得出超
氧阴离子自由基（O2-）的清除量。
以上就是超氧阴离子自由基清除实验的实验过程，通过这个实验，可
以测量超氧阴离子自由基（O2-）的清除量，这对于环境中污染物的控制
有着非常重要的意义。
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·O2ˉ自由基清除实验
(1) 实验原理
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯
即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。
·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。
(2)试剂
Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)
实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用
Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)
0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)
NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,
黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)
实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用
PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,
800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。
实际配制500mL。
高压灭菌，室温保存。
PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上
Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度
实际配制见记录本！
HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)
实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。
NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱
(3) 测定方法
超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。
样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。
Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
LWT, 40:955-962.
A）在96孔板孔中依次加入100μL 黄嘌呤(0.4mmol/l)和NBT(0.24mmol/l)的混合液(每种各50μL，溶于0.01mol/l的PBS，pH=8.0)，100μL黄嘌呤氧化酶(0.049units/ml), 50μL 样品溶液
B）混匀后37℃孵育30min, 酶标仪测OD560值(扣除OD800值)。
不加样品溶液作为空白对照，Vc(维生素C)为阳性对照，每个浓度的样品平行测定三次，分别计算清除率及样品的IC50。
IC50的计算，运用NDST 软件包进行。
(4) 样品清除率=（OD空白-OD样品）/OD空白×100%.
PS：某些样品在水中溶解度不好的可在聚四氟乙烯管内水浴孵育，再取反应液到96孔板中测试。
所加反应试剂按比例增加。
所有。