天蚕素类抗菌肽的抗菌性能测定及其性质研究

天蚕素类抗菌肽的抗菌性能测定及其性质研究伍小松1,罗振福1,李俊波2,杨丹丹1,贺建华1,范志勇1(1.湖南农业大学动物科技学院,长沙　410128;2.湖南省唐人神研发中心,株洲　412002)摘要:本试验通过检测天蚕素类抗菌肽的抗菌性能及各项抗菌性质,探究其对常见致病菌的抑制和杀灭作用。

通过对抗菌肽抗菌性能及热稳定性的测定,结果表明,天蚕素类抗菌肽对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制效果,三者的最小抑菌浓度分别为4500、3500、3500μg/mL,此外,该产品耐热性和耐酸性效果较佳,在100℃水浴15min后或p H为1时仍表现出对金黄色葡萄球菌的抗性。

关键词:天蚕素;抗菌性能;耐酸性;耐热性中图分类号:Q516 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009)022******* 抗菌肽具有较好的广谱抗菌性能,相对于抗生素而言,具有无残留、效价高、无毒害作用等优点,是抗生素潜在的替代品,其已成为目前各国学者研究的热点之一。

天蚕素是抗菌肽众多族类中重要的一种,早在20世纪70年代就由瑞典科学家Boman在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕(hy atop hora cecropi a)时分离得到。

目前,纯化的抗菌肽已被证明对各种革兰氏阳性菌和阴性菌有良好的杀灭作用,但对于天蚕素类抗菌肽产品的抗菌性能目前鲜见报道。

本试验试图通过一定抑菌试验检测其是否有同样的作用或性质,为该类产品在畜牧业中的应用提供借鉴。

1　材料与方法1.1　试验菌株　试验用的大肠杆菌(Escherichiaco2 li)、沙门氏菌(S almonelladerby)、金黄色葡萄球菌(S tapylococcusaureur)、链球菌(S treptococcus suis)4种菌均由湖南农业大学动物医学院分离鉴定。

1.2　培养基　①液体培养基:牛肉膏10g、蛋白胨10g、氯化钠5g,加水定容至1000mL,p H7.2,1×105Pa(121℃)高压灭菌20min。

②固体培养基:除液体培养基外,每1000mL加20g琼脂,1×105Pa(121℃)高压灭菌20min,备用。

或采用45g 营养琼脂配制1000mL固体培养基。

试验用抗菌肽是由中国农业大学农业部饲料工程中心提供的天蚕素抗菌肽产品,有效含量为10%。

1.3　抗菌肽产品抗菌性能的测定收稿日期:2008207207作者简介:伍小松(1977-),男,湖南人,博士生,研究方向:单胃动物营养。

通讯作者:范志勇(1973-),男,副教授,山西人,研究方向:动物营养生理调控和饲料资源开发与利用研究。

E2mail:fzyong04@ 1.3.1　产品浓度配制及稀释　取适量抗菌肽产品用无菌蒸馏水配制成以下浓度的溶液:5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000μg/mL。

并将1000μg/mL浓度的抗菌肽按倍比稀释法稀释成以下浓度:500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125μg/mL,前后共计18个浓度。

1.3.2　抗菌肽产品抗菌活性的测定1.3.2.1　纸片法测定抑菌活性　采用普通琼脂培养基(陈玉萍,1996;杨敬辉等,2006),菌液浓度在活化培养后稀释成106～107CFU/mL。

在无菌操作下,注入加热融化的培养基20mL于直径9cm的培养皿中,使其在底部均匀分布,当冷却到不烫手时分别向每个培养皿中加入2mL菌悬液,摇匀,凝固后,在无菌操作条件下,用镊子夹灭菌滤纸片(直径为6mm)放于培养皿上,轻轻加压,使其与平板培养基接触无空隙,然后用移液枪吸取20μL3500μg/mL 的药液,缓缓滴入纸片内,平放于37℃恒温培养箱中培养18h,观察纸片周围有无抑菌圈及抑菌圈大小。

1.3.2.2　最小抑菌浓度的测定　采用固体培养基连续稀释法(陈文伟等,2005;冯家伍,2007),取3.90625～1000μg/mL9个浓度样品8mL分别加到无菌培养皿中,再加入12mL保温于45℃水浴中已灭菌的培养基,充分摇匀,冷凝,待用。

各平板中样品的最终浓度为:400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。

用移液枪吸取各试验菌液2 mL,接种于各药液的培养基上,每点含菌量约为104～105CFU/mL,在37℃恒温培养箱中培养18 h,观察记录对各菌的最小抑菌浓度。

1.3.3　抗菌肽产品热稳定性的测定　将配制好的各浓度药液分别于100℃的沸水中水浴5、10、15、20、30min,然后检测其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。

1.3.4　p H对抗菌肽产品活性的影响　将3500μg/mL的抗菌肽药液用三氟乙酸依次调整p H至4.0、3.0、2.0、1.0,再测定其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。

2　结果与分析2.1　抗菌肽抗菌性能的测定2.1.1　抗菌肽的抑菌效果　试验结果显示(图1),大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果存在明显差异。

其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均出现抑菌圈,但是三者只有金黄色葡萄球菌结果更为明显(14.5mm),大肠杆菌(11 mm)和沙门氏菌(10mm)(极不明显,只有类似的痕迹)抑菌圈直径较小,且在圈内出现细菌,只是不及培养基内数量。

链球菌经多次试验均没有抑菌圈出现,说明该抗菌肽产品对于链球菌没有抑制效果。

图1　抗菌肽产品抗菌活性试验注:1为大肠杆菌;2为金黄色葡萄球菌;3为沙门氏菌。

2.1.2　最小抑菌浓度的测定　采用1.953125～500μg/mL9个浓度测定最低抑菌浓度时,均没有抑菌圈出现,所以改用1000～5000μg/mL9个浓度,发现出现抑菌圈,但并不是随浓度的升高抑菌圈直径逐渐增大,3种菌的最低抑菌浓度见表1。

表1　抗菌肽产品对各种细菌的最小抑菌浓度(μg/mL)试验菌种 最小抑菌浓度大肠杆菌4500沙门氏菌3500金黄色葡萄球菌35002.2　抗菌肽产品热稳定性的测定　将配制好的各浓度药液分别经100℃的沸水水浴5、10、15、20、30min,然后检测其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性(图2)。

结果表明,沸水浴5、10、15min后抗菌肽产品仍具有较好的抗菌性能,沸水浴20、30min后虽然发现类似于抑菌圈的环,但是在该环内出现细菌,且环的形状不规则,30min后该现象更为明显。

说明抗菌肽产品对高温具有较强的耐受性,但在高温条件下,随着时间的延长,其对金黄色葡萄球菌的抑制性能逐渐减弱或消失。

2.3　p H对抗菌肽产品抗菌性能的影响　抗菌肽产品溶液经过p H4.0、3.0、2.0、1.0处理后,观测其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(图3)。

结果发现,4种p H对其抗菌性能均没有太大影响,但p H为1.0时抑菌圈最小,且圈内有一定细菌出现。

由此可见,抗菌肽产品具有较好的耐酸性能,但随着p H降低抗菌活性减弱。

3　讨论3.1　抗菌肽产品抗菌性能和最小抑菌浓度　本试验结果表明,该抗菌肽产品具有一定抗菌性能,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌产生一定抗性,其中以对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳,另外两种的抑菌圈均不明显,说明不同的细菌对其敏感性不同。

由于采用1000μg/mL及以下倍比稀释的浓度做抗菌活性的测定时,试验中没有发现抑菌圈,所以选择加大浓度,重新筛选适合的抑菌浓度做抗菌活性的测定。

经最小抑菌浓度试验结果发现,对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为3500μg/mL,大肠杆菌为4500μg/mL,综合各项指标后,确定采用3500μg/mL作为最佳浓度,既可以保证良好的抑菌效果,又可以节约抗菌肽产品。

彭蓉等(2002)利用粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽检测其抗菌性能,结果发现,该抗菌物质具有较广的抗微生物活性,特别是对革兰氏阴性菌中的沙门氏菌和大肠杆菌,酵母菌中的白色念珠茵,植物病源真菌中的花生白绢病菌和小麦赤霉病菌具有较强的抑菌活性,但抑菌活性以大肠杆菌、白色念珠菌最佳(+++),金黄色葡萄球菌次之(++),其他菌种再次之(+)。

刘慧明等(2008)试验结果证明,鲎抗菌肽对隐球菌(+++)和枯草杆菌(+++)有抑制作用,24h最小抑菌浓度为2.28μg/mL,枯草杆菌的最小抑菌浓度为45μg/mL,而对变形杆菌无效。

此外,还有大量研究结果表明,对于不同种类的抗菌肽,其抗菌性能和最小抑菌浓度也不同(周义文等,2008;陈青等, 2005;陈丽颖等,2005)。

究其抗菌机理,一般认为是抗菌肽能改变或破坏细菌质膜结构,导致膜穿孔形成离子或溶质通道,引起细胞内容物大量渗出,最终导致细菌死亡(Dekker等,2001)、抑制细菌的呼吸作用(Fehlbaum等,1996)和蛋白质的合成(Carls2 son等,1991)等。

本试验中4种细菌对于该天蚕素类抗菌肽产品的敏感性也证实了这一点。

但是,该产品对大肠杆菌的抑菌效果与以往研究存在一定差异,即对大肠杆菌同样表现出一定抗性,但作用不太强烈,抑菌圈较小,对链球菌则无抑制效果,这其中原因归结为:①抗菌肽品种和结构均不相同,天蚕素分子质量约为4ku,为线性分子,表现出较强的阳离子特征,且缺乏分子内二硫键(王燕等,2007),相比其他种类抗菌肽,其一级结构(即氨基酸残基排列顺序、数目、种类)、二级结构(α2螺旋、β2转角、β2片层)表现出明显差异,结构不同直接导致性质的不同。

②所选用抗菌肽产品性质和浓度不同。

粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽为三氟乙酸提纯的粗产品,刘忠渊等(2004)使用的新疆天蚕素为通过酵母表达系统所表达的产物,浓度为330mg/mL,二者有效浓度均远远高于本试验所采用的天蚕素产品(有效成分仅为10%,且不能完全溶于水),浓度的差异直接导致抑菌活性的不同。

但该产品与其他抗菌肽或同类天蚕素粗提物的活性差异的原因还有待进一步研究。

3.2　温度和p H对抗菌肽产品活性的影响　许兵红等(2005)研究结果发现,果丝光绿蝇幼虫经针刺诱导的抗菌肽100℃水浴1min后仍有抗菌活性, 100℃处理3min后活性丧失;但80及60℃水浴5 min后仍有抗菌活性,说明针刺诱导的丝光绿蝇抗菌肽的抑菌活性具有一定的热稳定性,且不同温度下热稳定性不同。

此外,包括牛乳酪蛋白来源抗菌肽和稻蝗抗菌肽等也证明具有较好的抗高温能力,经60℃处理活性基本无影响,但随温度升高,活性逐渐下降(陈青等,2005;Wang等,1998)。

刘忠渊等(2004)研究结果发现,等体积0.1mol/L的HCl 与新疆天蚕素抗菌肽的混合物随着HCl浓度的增加,抗菌肽的作用逐渐减弱,当HCl浓度达到0.4 mol/L时,所产生的抑菌圈,主要起作用的是HCl,当HCl浓度达到0.5mol/L时,抗菌肽的活性受到抑制。