MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间的简化计算解读
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT比色法-细胞增殖及细胞活性测定-实验
MTT比色法*本实验要严格无菌操作，遵守细胞间操作流程。
操作流程及步骤：1、配制MTT溶液[1-7]。
以96孔板实验操作计算用量96孔板：高糖：60孔*180=10800ulMTT：60孔*20ul=1200ul2、先将原有培养液弃去，用PBS洗洗两次[8-9]。
3、将配制好的MTT溶液每孔200ul加入96孔板中，孵箱孵育3-4小时。
4、弃MTT液，MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走[10]。
5、每孔加入150ulDMSO，摇床10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
6、测OD值，酶标液设置波长范围：490nm-----492nm 510nm-----562nm[11]。
7、终点法----波长492----选择样本范围----读取----原始数据----输出----保存。
心得体会及注意事项：1、配制MTT溶液要避光。
2、MTT浓度网上查得5mg/ml。
3、经过0.22um微孔滤膜滤过。
4、血清和双抗会影响MTT染色效果，故培养液用不含血清和双抗的高糖。
5、计算配制溶液剂量，有时枪不准或损失较多，每板多加1ml高糖。
6、96孔板最外层不用所以总计孔数为60孔。
7、高糖180ul+MTT20ul(每孔)）。
8、操作过程要防止吹落细胞，加液延碧缓慢加入。
9、PBS液要高压灭菌过的。
10、有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
11、96孔板底部要洁净，否则OD值不准。
目的及原理MTT实验目的：细胞增殖及细胞活性测定。
MTT实验原理：为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT法
MTT法原理MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
材料MTT 浓度为5mg/ml（4°C）：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
DMSO（纯的，买来直接用）或者SDS/HCl：SDS 10g+异丁醇5ml+HCl 10M 0.1ml 双蒸水配成100mlLipofectamine TM2000，酶标仪1640培养基、小牛血清、胰酶、96孔板Hct116细胞等等。
microRNA（实验室现有的）方法1、收集对数期细胞，PBS洗涤一次，1ml胰酶消化，加3ml培养基吹打，混匀细胞进行计数，调整细胞浓度105/ml，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至10000每孔。
2、5%CO2，37℃孵育，培养12-24h，此时细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,先用PBS洗涤一次，在加入浓度梯度的microRNA以及脂质体混合液，进行转染，（转染过程可根据脂质体购买时说明书操作，一般是将脂质体和microRNA分别加入到对应无血清培养基进行稀释，再混合到1.5ml离心管中进行作用15min）一般3个梯度,每孔100ul,设3个复孔，3个空白对照。
MTT法原理、步骤以及注意事项,综合汇总
MTT法原理、步骤以及注意事项,综合汇总摘要：MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的,我目前用的都是570nm)测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害.MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可.在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好.需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内.MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了.我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4℃避光保存,在两周内用完.MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl 8g ＋Kcl 0.2g ＋Na2HPO4 1.44g ＋KH2PO4 0.24g 调pH 7.4,定容1L.普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件,培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3：呈色：培养3-5天后,每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解.4：比色：选择490nm（570nm）波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.药物MTT法实验步骤贴壁细胞：（我的主要操作是贴壁细胞）1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-10000 孔,（边缘孔用无菌PBS填充）.2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞贴壁,加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况.3: 5%CO2,37℃孵育24-72小时,倒置显微镜下观察.4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h.若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液.5: 终止培养,小心吸去孔内培养液.6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm （570nm)处测量各孔的吸光值.7: 同时设置调零孔即空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）.悬浮细胞：1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对照（加100ml 1640）.2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h 后可跳过步骤4）,直接酶标仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值.5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔.注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度.每孔1000-10000个,但是也要看细胞种类和状态.我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖,铺过2000至8000个每孔.2000太低,8000过高,对于阴性组高于5000个吸光值就很大,大于1.5.所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000.一般每孔4000个细胞为宜(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液.(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照.其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零.(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系.（阴性组在0.8-1.2,加药组在0-0.7.）(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO.加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定(6) MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值.(7) 铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致,一般每加几孔就混匀一下.我一般是加完一排复孔就混匀一次.。
mtt法试验原理
mtt法试验原理你听说过MTT法试验吗？哦，这可不是个高深的科研术语，而是一个让你在实验室里“嗨”起来的超级简单又实用的方法。
想知道它有什么神奇之处吗？别急，慢慢跟我来。
MTT法啊，简单说就是用来测量细胞存活率和活性的一种小方法，虽然名字听起来挺“硬核”的，但其实它的原理很容易理解，绝对不是那种让你看了头晕脑胀的复杂东西。
得跟你普及一下为什么要测细胞活性。
细胞就像人体里的小工厂，它们得保持活力才能做好自己的工作。
如果细胞死了，或者被药物什么的“干掉”了，那个身体就不行了。
那怎么知道它们死活呢？MTT法就能帮助我们搞清楚。
原理其实挺有趣的，简单说，它就是通过一个化学反应，利用一种叫做“MTT”的黄色粉末，测量细胞的“活性”。
等到它接触到活细胞时，它就会变成紫色，这个变化的程度，能直接告诉你细胞的健康状况。
MTT是怎么工作的呢？当我们把MTT试剂加入到培养的细胞中，活细胞里的一些酶会把MTT还原成紫色的物质。
也就是说，细胞越活跃，紫色的程度就越深，反之，如果细胞死掉了，MTT根本没法还原成紫色。
所以啊，通过量化这个紫色的变化，我们就能估算细胞的存活情况。
是不是听起来超简单？就像是用色彩来给细胞打分，活得好，色彩深，活得差，色彩浅。
明白了吧？MTT法可是有很多应用的呢。
比如说，科研人员用它来测试新药的效果。
新药能不能杀死癌细胞，或者能不能提高健康细胞的存活率？MTT法就是用来检验这些效果的。
研究者可不只是在药物研究中用它，像抗生素、抗病毒药物的效果也常常用MTT法来检验。
要是新药的效果特别好，那它把细胞杀得“体无完肤”，MTT还原反应就会显得很明显；要是新药没什么用，那MTT的反应就比较弱，颜色也不深。
再说了，MTT法为什么那么受欢迎呢？它的优点可多了。
首先操作简单，几乎每个实验室都有这种试剂，而且不需要多复杂的设备，用的就是普通的培养箱、离心机这些基础设施。
反应灵敏，可以快速获取结果。
你只需要几个小时就能知道你实验的成果，根本不需要等大半天。
MTT法观察细胞生长曲线
MTT法绘制生长曲线一细胞生长曲线：A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。
B、背景知识细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。
只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。
因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。
原理（选填项目）：细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。
C、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24培养板4. 胶塞（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。
3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。
培养3～5d常要给未计数的细胞换液。
4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。
9（五）、注意事项1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。
2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。
3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。
4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。
MTT细胞增殖检测方法
MTT细胞增殖检测方法MTT（3-[4,5-二甲基-2-噻唑硫基]-2,5-二苯基-2H-四唑）细胞增殖检测法是一种常用于评估细胞增殖能力的方法，被广泛应用于细胞生物学和药物筛选研究。
该方法基于细胞内的还原能力来检测细胞数量的变化，通过转化MTT为可溶性甲基蓝并测量其吸光度来反映细胞增殖的程度。
以下是对MTT细胞增殖检测方法的详细介绍。
MTT法的原理:MTT法的原理基于细胞内还原能力的变化。
MTT为一种黄色噻唑化合物，可以通过代谢作用被细胞内的还原型NADH和NADPH还原为紫色的可溶性产物，甲基蓝（formazan）。
甲基蓝比MTT更加容易溶解于溶剂中，可以通过吸光度测量来定量分析细胞的增殖情况。
MTT的实验步骤:1.接种细胞:从培养物中取出细胞，进行细胞计数，将细胞以适当浓度接种进所需的培养基中，培养到适当的阶段。
2.处理细胞:根据实验设计的需要，给予细胞不同的处理，如给予药物、生长因子或是改变其它培养条件。
3.制备MTT反应液: 将MTT溶解在适当的培养基中，使其浓度为5mg/mL。
过滤消毒。
4.处理细胞:从培养基中将培养物移至适当的96孔板中，每孔加入200μL的培养基和细胞，使其稀释到适当的浓度。
5.加入MTT反应液: 将MTT溶液加入到每孔中，使其最终浓度为0.5mg/mL。
6.孵育细胞:放回培养箱中孵育一段时间，一般为2-4小时，以保证足够的反应时间。
7.溶解产物:小心将培养基和反应产物去除，加入为其提供溶解产物的溶剂，如酒精或DMSO。
8.测定吸光度: 将溶液转移至96孔板中，使用光谱仪或酶标仪测量甲基蓝的吸光度，波长通常为570nm。
MTT法的优点:1.高灵敏度：MTT法对细胞的增殖状态非常敏感，可以准确地测量细胞数量的变化。
2.快速：MTT法的操作相对简单，可以快速获得结果。
3.廉价：MTT试剂相对便宜，可以在大规模实验中使用。
MTT法的局限性:1.只适用于已附着生长的细胞：MTT法只适用于附着生长的细胞，无法应用于悬浮细胞。
MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间的简化计算解析
1.MTT比色法测定细胞生长曲线
2018/10/31
细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也 是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性 的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的 悬浮然后贴壁，随后度过长短不同 的迟缓期（潜伏期），即进入大量 分裂的对数生长期。在细胞达到饱 和密度后，停止生长，进入稳定期， 然后退化衰亡。
t 24h( Lg 2 / [ Lg (a eb t ln 2 ) Lg (a eb t0 ln 2 )] t 24h( Lg 2 / [ Lg (a 2 ) Lg (a 2
bt b t0
)])
t (24h( Lg 2 / b((t t0 ) Lg 2)
t[24h( Lg 2 / (b t Lg 2)]
• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到 细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分 别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值 为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度 的对应关系，绘出标准曲线。
2018/10/31
• • •
2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简 化计算
2018/10/31
• 曲线拟合
• 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类 型来拟合观测数据，并用拟合的曲SS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦 福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功， 同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、 在芝加哥组建了SPSS总部。 • 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分 析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列 产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围， 并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2018/10/31
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到 细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分 别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值 为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度 的对应关系，绘出标准曲线。
• 通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是
Y a e
Y a 2
2019/2/27
b t
• 但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用
b t
• 作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。
• 又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 Y a 2b t 函数拟合模型，只有 Y a eb t • 于是我们可以通过变换
•
• 2.细胞生长曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞制成 1×10^4/ml的细胞悬液;分别接种于多块96孔 板 ,每孔 100μl ;在 24、 48、 72、 96及 120 h时间点取一块 96孔板 ,采用 MTT法测 量吸光值A值得到吸光值A值与时间的关系。 根据标准曲线计算出相应的细胞数 ,再绘 出细胞的生长曲线。
2019/2/27
• • •
2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简 化计算
2019/2/27
• 曲线拟合
• 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类 型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两 变量间的关系。
• SPSS
• SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦 福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功， 同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、 在芝加哥组建了SPSS总部。 • 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分 析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列 产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围， 并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2019/2/27
•
2019/2/27
2.MTT法（复杂，误差小）
• 原理 • MTT：全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide • 汉语化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四 氮唑溴盐 • 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。
以存活细胞数(万/mL)对培养时间 (h或d)作图，即得生长曲线。 一般而言，我们主要研究的是对 2019/2/27 数生长期的生长曲线。
测定细胞生长曲线的方法
1.细胞计数法（简单、最常用、有误差）
• • （1）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中 （2）24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞， 分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 • （3）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为 横坐标绘制生长曲线。 • 24孔板 细胞计数板
t 24h( Lg 2 / [ Lg (a eb t ln 2 ) Lg (a eb t0 ln 2 )] t 24h( Lg 2 / [ Lg (a 2 ) Lg (a 2
bt b t0
)])
t (24h( Lg 2 / b((t t0 ) Lg 2)
t[24h( Lg 2 / (b t Lg 2)]
Y a 2 ln 2b t b t ln 2 a e a e b k (其中k t ln 2) a e
b t
• 从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。
2019/2/27
• 原始数据
2019/2/27
• 曲线1. 培养天数 X ln2
k t ln 2
Ya e
b k
• 曲线2. • 进入对数生长期天数 X ln2
24h / b
2019/2/27
• 结果 • 曲线一. • b=0.855
Td 24h / b 28.070h
• 曲线二. • b=0.921
2019/2/27
Td 24h / b 26.059h
Td =t Lg2 / ( LgNt LgN0 )
• （Nt为对数生长期任一点的理论观察值,N0 为对数生长期理论初始值） • 计算比较复杂,而我们基于以往曲线进行理 论推导而行的理论倍增时间,计算相对简单。
2019/2/27
• 推导过程
Td t 24h[ Lg 2 / ( LgNt LgN0 )]
m=（t-2） ln2
Ya e
b m
• 依据以上变量进行曲线拟合 ,记录相应的a,b值。 2019/2/27
2019/2/27
2019/2/27
2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法
2019/2/27
• 细胞群体倍增时间的计算方法有2种。 • 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找 出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间, • 2.公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍 培时间,其为公式为：
•
活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性 的MTT还原，同时在细胞色素C 的作用下，生成不 溶于水的蓝色（或蓝紫色）络合物甲臜。 • 按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪在490nm （或570nm）波长处测定甲臜 的光吸收值（A值）。 • 在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比， 因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。 • 由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应。 • 2019/2/27
1.MTT比色法测定细胞生长曲线 2.细胞生长曲线的拟合及细胞群体倍 增时间
2019/2/27
细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也 是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性 的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的 悬浮然后贴壁，随后度过长短不同 的迟缓期（潜伏期），即进入大量 分裂的对数生长期。在细胞达到饱 和密度后，停止生长，进入稳定期， 然后退化衰亡。