M TT 比色法测定细胞生长曲线 - 资料中心 - 生物在线
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。
细胞生长曲线的测定
细胞生长曲线的测定细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。
在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。
以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。
测定细胞生长曲线有三种常用的方法，计数法、MTT法和CCK-8法，下面就这几种常用方法做详细说明。
计数法1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。
根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，计算平均值，连续计数7 d4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
MTT法1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。
根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养3．24 h后开始检测细胞生长情况，制备1 mL细胞悬液。
空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。
加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h，使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶4．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解5．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。
MTT分解比色法测定细胞生存和增殖
MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferationContributed byJoan M. ChapdelainePharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471INTRODUCTIONIn 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effectivebecause of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal.Applications of the MTT assayThe use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal.Application Note5The sensitivity of the MTT assay is dependent on the cell type, their average metabolic status, and the technique selected for solubilizing the formazan crystals. For example, the MTT assay was shown to detect as few as 200 EL4.3 cells per well and was linear to 50,000 cells per well.1 Whereas the sensitivity for T-cell blasts, which produce less forma-2The MTT assay, like the dye exclusion assay, must be optimized for seeding conditions and assay duration to obtain satisfactory results. A standard curve for formazan production as a function of the cell number and the growth rate should be determined for each cell type. Once optimized the MTT assay has proven to be adaptable to the needs of the exper-imental design and has been shown to be a practical method in a variety of applications: 1Mosmann1 reported using the MTT assay to measure proliferative lymphokines, mito-gen stimulations, and complement-mediated lysis.2Cell activation levels have been quantified independent of proliferation.33Cell viability assays could be run more rapidly using MTT rather than counting cells using trypan blue exclusion.44This colorimetric assay had been used with anti-proliferative monoclonal antibodies,5 growth factors,2,6 and chemotherapeutic screening.7, 85Tada et.al.6 showed the quantitative assay for interleukin 2 using the MTT assay to be equivalent to the [3H]-thymidine incorporation assay. The mean of the standard errors for the MTT assay was 3.9% as compared to 3.5% observed in the [3H]-thymidine incorporation assay and the results from the two assays were shown to agree.METHODS AND MODIFICATIONS Table 1 is a summary of various MTT colorimetric assay methods. The MTT assay as developed by Mosmann1 uses the same standard 96 well flat bottom tissue culture plate for the initial incubation of the cells and assaying for the cell number. At the end of the ini-tial incubation, a small volume of an MTT solution was added to each well of the culture plate. The plate was incubated to allow the formazan crystals to accumulate. The crystals were solubilized by the addition of an acidic alcohol solution before making an optical density measurement.To obtain complete mixing of the acidic alcohol solution with the media, the liquid in each wells had to be manually agitated with a pipet. The alcohol solubilized the formazan crys-tals and the acid lowered the pH of the medium to minimize interference due to the phenol red indicator which would interfere with the formazan reading. The yellow, acidic form ofthe dye does not interfere. The plates were read at 570 nm with a 630 nm reference to negate the effect of cell debris and precipitated proteins which may be produced by the acidic alcohol addition.Table 1: Summary table of MTT colorimetric assay methods.Denizot and Lang 2 found the tetrazolium dye assay as described by Mosmann to be less sensitive than the [3H]-thymidine uptake assay for their application. They modified the MTT method to improve sensitivity and performance. They used a microplate with a smaller well volume, doubled the MTT concentration, and dissolved it in a serum free media without the phenol red indicator. The unreacted MTT was removed from the centri-fuged plate before solubilizing the formazan crystals with isopropanol. Removing the serum proteins and the phenol red indicator reduced the background optical density and the need for an acidic solvent, respectively. Finally, a different reference wavelength, 690 nm, was selected which increased the signal by about 25%. The authors report that these modifications improved the sensitivity of the MTT assay 2- to 4-fold over the Mosmann procedure.T. Mosmann 1F. Denizot & R. Lang 2 H. Tada et.al. 6JChapdelaine Unpublished M.B. Hansen,et al. 9 J. Carmichael, et al. 7Sample V olume 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.2 mL 0.1 mL 0.2 mL Intermediate Steps None Remove medium None None None ul None MTT V olume 10 µL 10 µL 20 µL 20 µL 25 µL 50 µL Concentratio n 5 mg/mL 5 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL 5 mg/mL 2 mg/mL MTT Incubation4 Hours3 Hours4.5 Hours4 Hours2 Hours4 HoursAdherent CellsNonadherent Cells Intermediate StepsNoneCentrifuge microplates, remove unreacted MTTNoneRemove 180 µL mediumNoneRemove all mediumCentrifuge microplates, remove 170 µL mediumSolubilize Formazan V olume 150 µL 50 µL 100 µL 180 µL 100 µL 100 µL 100 µL SolventIsopropanol/HCl Isopropanol10% SDS in 0.01 M HCl10% SDS20% SDS in 50% DMF, pH 4.7Mineral oilDMSOIncubation 5 Minutes 1 Minute with shaking Overnight at 37°C Overnight at37°C Overnight at 37°C Overnight at 40°C 5 Minutes Read 570 - 630 nm 560 - 690 nm590 nm570 - 650 nm 570 nm 565 nm540 nmComments:•Serum proteins precipitate with acid/alcohol 1,2,6 •Mechanical mixing required to solubilize formazan 1,6 •Plates read with in 1 hour 1•Use half-area microplates 2 •Use serum free mediumto eliminateproteinprecipitation 2 •No phenol red 2•Use a detergent todissolveformazan 6 •Good mixing without added agitation 6 •Stable color 6 •Less protein precipitation 6•Higher detergent concentration •No acid to precipitate proteins•Phenol red in medium is not a problem since medium is removed•Improved solubilization of formazan crystals 9•More signal relative to acid/alcoholor acid/SDS solubilization 9 •Improved signal relative to alcoholsolubilization 7 •Stable color 7 •Lessreproducible 7 •Signalintensitydepends onresidual medium volume 7•Unstable color7Tada et. al.6 re-examined the MTT assay in detail and modified the assay to make it possi-ble to measure a larger number of samples at one time with less labor and with greateraccuracy. The MTT concentration was doubled and the incubation time was increased bya half an hour. The most significant modification was in how the formazan crystals weredissolved. In place of the acidic alcohol solution, an acidic detergent solution was substi-tuted. This modification resolved two drawbacks with the previously described MTTassay. First, the acidic detergent solution mixed well with the growth medium thus elimi-nating the need to mix each well and, second, the removal of the alcohol reduced the like-lihood of serum protein precipitation. Variations of this method have since beendeveloped. Chapdelaine (unpublished) removes the medium from the well of the tissueculture plate before adding the detergent solution, thus eliminating the need to acidify themedium. Hansen et. al.9 used a buffered detergent and added dimethyl formamide (DMF)to improve the solubilization of the formazan crystals.Carmichael et. al.7,8 modified the MTT assay and developed two protocols: one for adher-ent and the other for nonadherent cell lines. For adherent cells, the media was aspiratedfrom the wells and mineral oil was used to dissolve the formazan crystals because it is rel-atively nontoxic. The plates were read at 570 nm. Plates with nonadherent cells were cen-trifuged after the incubation with the MTT. The medium was aspirated from the wellsleaving about 30 µL behind. The formazan crystals were solubilized with dimethyl sulfox-ide (DMSO) which rapidly solubilized the formazan crystals but produced an unstablecolor. The absorbance plate was read using a 540 nm filter within minutes. CONCLUSION A problem with the MTT assay, the difficulty of solubilizing the formazan crystals with-out precipitation of serum proteins, may be mitigated by using more effective solubilizingagents and alternate procedures. Precipitated protein and cellular debris present in the cul-ture plate wells are a potential source of experimental error because they interfere with theoptical readings. Dual wavelength photometry, reading the plates at a principle and a ref-erence wavelength, is used to cancel out the effect of the debris. If the interfering materialshifts position between readings, the benefit of dual wavelength photometry is lost. TheMAXline microplate readers do not move the microplate during the read thus reducing thechance of debris shifting. The result is better precision and an assurance that the micro-plate reader is not a source of experimental variation.REFERENCES1Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application toproliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65: 55-63 (1983).2Denizot, F. and Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modi-fication to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.J. Immunol. Methods 89:271-277 (1986).3Gerlier, D. and Thomasset, T. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activa-tion. J. Immunol. Methods 94:57-63 (1986).4Penit, C. and Papiernik, M. Regulation of thymocyte proliferation and survival bydeoxynucleosides. Deoxycytidine produced by thymic accessory cells protect thy-mocytes from deoxyguanosine toxicity and stimulates their spontaneous proliferation.Eur. J. Immunol. 16:257-263 (1986).5Vaickus, L. and Levy, R. Antiproliferative monoclonal antibodies: Detection and ini-tial characterization. J. Immunol. 135:1987-1997 (1985).6Tada, H., Shiho, O., Kuroshima, K., Koyama, M., and Tsukamato, K. An improvedcolorimetric assay for interleukin 2. J. Immunol. Methods 93:157-165 (1986).7Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J.D., and Mitchell, J. B. Evalua-tion of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay. Assessment ofchemosensitivity testing. Cancer Res. 47:936-942 (1987).8Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J.D., and Mitchell, J. B. Evalua-tion of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay. Assessment of radiosen-sitivity. Cancer Res. 47: 943-946 (1987).9Hansen, M.B., Nielsen, S.E., and Berg, K. Re-examination and further development ofa precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Meth-ods 119:203-210 (1989).0120-0114A TRADEMARKS: SPECTRAmax, SPECTRAplate, and MAXline are trademarks of Molecular Devices Corporation. SOFTmax is a registered trademark of Molecular Devices Corporation..。
细胞生长曲线实验
细胞生长曲线实验细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。
在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。
以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。
实验方法原理细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是判定细胞活力的重要指标。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是判定细胞活力的重要指标。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。
细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。
实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。
分。
细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。
实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3—（4,5-Dimethylthiazol—2—yl)-2，5—diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3—(4，5—二甲基噻唑-2)-2，5—二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝.是一种黄颜色的染料。
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0。
5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS)或无酚红的培养基中,用0。
22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0。
7 范围内.MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在—20度长期保存,避免反复冻融，最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配,直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT法原理步骤
MTT法原理步骤细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
细胞生长曲线的测定
细胞生长曲线的测定细胞生长曲线的测定一：背景与原理生长曲线是测定细胞生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后渡过长短不同的潜伏期，即进入快速生长的指数生长期。
在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。
为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。
通常计数6天。
为精确起见，一般每次实验设3个平行重复。
【晶莱生物】二：材料、试剂与仪器1. 实验材料Hela细胞系。
2. 实验试剂DMEM培养基（青霉素，链霉素，10%血清），0.25%胰蛋白酶溶液，台酚蓝染液。
3. 实验仪器超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，微量移液器，血细胞计数板，培养瓶，离心管，移液管，废液缸，盖玻片，24孔板。
三：方法与步骤1.取生长良好的细胞，用培养基制成细胞悬液后计数。
根据细胞计数结果按5×104/mL作传代培养接种于24孔板中，共接种21孔细胞。
1 ml/孔。
余下三孔可设传代培养的对照。
2.24h后每天记录细胞数目，每次取3孔细胞，分别进行计数。
计算平均值。
连续计数7d。
细胞用胰酶消化后加入一定量的培养基，混匀制成细胞悬液。
取少量悬液与台酚蓝1:1混合。
取一干净的血细胞计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。
注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而使细胞计数不准。
3.低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。
找出计数板上的方格，计算四角大格内总细胞数，压大格线者只计左侧和上方，不计右侧和下方细胞悬液中细胞密度计算公式为：细胞数/mL=（四角大格内细胞数/4）×104×24.根据细胞计数结果，以单位细胞数（细胞数/mL）为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
MTT比色法测定细胞生长曲线_郝新保
MTT比色法测定细胞生长曲线郝新保 张利朝 殷 缨 韩秀珍 陶秦渝 郝晓柯 张盈华(第四军医大学唐都医院中心实验室 西安710038)关键词 细胞生长曲线 M T T比色法中图号 Q28 在有关肿瘤细胞生物学的研究中,我们常常要测定细胞的生长状态,制作细胞生长曲线,以往的方法是取少量细胞在镜下或计数仪中计数,然后标注在坐标纸上,制作出细胞生长曲线.这种方法对同一样品要求计数几次取平均值,不但操作繁琐、费时,更主要的是误差较大,可达到20%～30%[1],包括取样误差、计数误差等.为了能简便、准确地测定细胞数,我们建立了基于M T T比色法的细胞生长曲线制作方法.1 材料和方法1.1 试剂 R PM I1640培养基为GIBCO公司产品,小牛血清为杭州四季青产品,M T T为SERV E产品,其它试剂均为国产.1.2 仪器 HL-2029P型酶标自动分析仪为国营二六二厂产品,Pr ofileⅡ,Elite型流式细胞仪为美国CO U L T ER 公司产品.1.3 细胞培养 选用人乳腺癌细胞系SK-BR-3.细胞培养在含10%小牛血清的RPM I1640培养基中,37℃,5% CO2.1.4 镜下计数测定细胞数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,用计数板按常规方法在倒置显微镜下计数,每个样品测三次,取平均值.1.5 流式细胞仪计数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,取0.2ml细胞过滤后用流式细胞仪自动计数.1.6 M T T比色法计数 M T T比色法计数为间接计数,先要做出细胞的标准曲线,然后根据欲测样品的A值计算出相应的细胞数.1.6.1 制作标准曲线 准备细胞悬液,从1×107细胞/200μl/孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞/孔,每个稀释度三孔细胞,培养板置37℃培养4h后细胞贴壁,每孔中加入20μg M T T继续培养4h,然后吸出150μl培养液,加入等量DM SO,37℃20min,570nm处测定吸光度[2],用二六二厂酶标自动分析仪程序绘出细胞标准浓度曲线.1.6.2 制作生长曲线 调整细胞的浓度,按2×103/孔接种在96孔板中,置37℃培养,每天用M T T比色法测定3孔细胞的A值,在标准曲线上计算出相应的细胞数,即可绘出细胞的生长曲线.郝新保,男,32岁,讲师,主治医师2 结果2.1 细胞数与A值的标准曲线 根据各稀释度的A值制作细胞浓度的标准曲线,如图1.图1 SK-BR-3细胞浓度的标准曲线2.2 肿瘤细胞的M T T比色法生长曲线 根据每天测定的三孔细胞的A值在标准曲线上求得其对应的细胞数,7～10d后即可绘制细胞生长曲线,如图2.图2 SK-BR-3细胞的生长曲线2×;--0.2×;…20×.2.3 细胞接种密度对生长曲线的影响 当细胞接种密度较低(2×102/孔)和较高(2×104/孔)时,对细胞生长曲线的形状有一定的影响,如图2.2.4 M T T比色法与镜下计数法及流式细胞仪计数法的比较 为了比较M T T比色法和镜下计数法制作的细胞生长曲线,用流式细胞仪的计数结果作为参照,结果表明M T T 比色法与流式细胞仪计数结果更接近,明显优于镜下计数法的结果.3 讨论 从结果可以看出,用M T T比色法制作细胞生长曲线完全可行.因其减少了取样和计数误差,免除了贴壁细胞的消化等,使其具有简便、快速的特点.对几种不同方法制作的生长曲线进行比较发现,M T T比色法在客观性上也比镜下计数法有了很大的提高.要掌握好这个方法首要的一点是标准曲线的制作,稀释一定要准确,在保证标准曲线如实反映细胞数的基础上,才能制作出好的生长曲线.在测定时,接种细胞的密度对生长曲线的影响较大.从图2可以看出,接种密度过高或过低都不利于生长曲线的制作,这与细胞的生长能力有关,可进行简单的预实验确定,一般在(1～5)×103细胞/孔为好.尽管M T T比色法测定细胞生长曲线具有很多优点,但因其需要使用自动酶标仪而受到了一定的限制,如果能开发出细胞生长曲线专用软件,就能摆脱自动酶标仪的限制,利用普通酶标仪就可以开展工作了.参考文献1鄂 征.组织培养技术.第2版.北京:人民卫生出版社,1993: 1542候 健,孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志,1993;16(4):208～210(收稿1996-09-17 修回1997-02-04)编辑 王小仲化云宁滴眼液的质控标准王 颖 雷其云 蒋永培 樊亚萱 (第四军医大学西京医院药局 西安710033)关键词 化云宁 钾离子 耐缺氧 质量控制 刺激性中图号 R289 我院研制的新药化云宁滴眼液为一复方中药制剂,具有活血化瘀、退翳明目的功效,是治疗角膜瘢痕(角膜云翳,角膜斑翳)的理想药物.在化云宁研制和生产的质量控制上,我们采用了钾离子(K+)含量测定、刺激性实验及生物检定方法作为质控标准,保证了化云宁滴眼液在临床上安全和有效地使用.1 材料和方法1.1 药物与试剂 化云宁滴眼液由丹参、黄芩和金银花等生药的提取液按眼药常规要求制备而成;心得安注射液(1mg/ml,批号830706,北京制药厂);丹参素注射液(10 mg/ml,批号820401,上海医科大学附属中山医院制);生理盐水(2ml/支,批号8303023,自制).1.2 实验动物 BA L B/c小鼠,雄性,6～8周龄,体重18～21g;新西兰白兔2只,雄性,编号分别为543,554,体重分别为2.05kg和2.45kg(以上动物均由本校实验动物研究中心提供).1.3 K+含量测定[1] 用System E4A型火焰光度计(美国BECKM AN公司制造)分别测定化云宁滴眼液成品及其组方中各味药的提取液(丹参,黄芩,金银花等)中K+浓度.样品在测定前均用N aO H调p H值至6.8～7.0.1.4 刺激性实验 采用家兔滴眼法.选取健康新西兰白兔2只,编号分别为543,554,用药前,检察兔眼结膜血管、角膜透明度等均属正常,如①结膜无血丝及发红;②王 颖,女,42岁,主管药师角膜不浑浊,呈透明状;③眼角无分泌物.左眼点化云宁滴眼液2滴(批号850619),右眼点生理盐水2滴作为对照,用药后开始记录时间,并观察眼部反应情况.结果判定以上述用药前检察的①～③项指标无异常为无刺激症状表现(-),否则为被检眼药有刺激性(+).1.5 常压耐缺氧实验 按表2中的剂量,小鼠腹腔(注射)给药(批号830509,自制)后30min,放入容量为250ml的磨口玻璃瓶中,瓶内放钠石灰5g,每瓶放小鼠一只,放入后用凡士林密封盖紧,并开始记录其存活时间[2].以生理盐水组为对照,比较各组间统计学上的差异,统计学处理采用t检验.2 结果2.1 药液中K+浓度的测定 在中药滴眼液与中药注射液中常含有来源于植物药材本身的K+,其浓度过高可引起局部疼痛.我们采用中草药注射液的K+浓度限定范围[40%～60%(mg/ml)以下][3]做为化云宁滴眼液的质控标准之一.六个批号的化云宁滴眼液中K+浓度测定的结果见表1,均符合限定标准.此外,对化云宁滴眼液中丹参,黄芩和金银花三种主药提取液的K+浓度也分别进行了检测,结果(三次测定的平均值)分别为47.6%,0.8%和1.2%(mg/ml),由此可见,该滴眼液中的K+主要来源于丹参.2.2 刺激性实验 经2只新西兰白兔左、右眼对照实验观察,除1只兔左眼在用药液后15min时观察有轻度流泪外,其余均无任何刺激性反应.因此,该眼药符合有关规定.。
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M TT比色法测定细胞生长曲线
郝新保 张利朝 殷 缨 韩秀珍 陶秦渝 郝晓柯 张盈华(第四军医大学唐都医院中心实验室 西安710038)
关键词 细胞生长曲线 M T T比色法
中图号 Q28
在有关肿瘤细胞生物学的研究中,我们常常要测定细胞的生长状态,制作细胞生长曲线,以往的方法是取少量细胞在镜下或计数仪中计数,然后标注在坐标纸上,制作出细胞生长曲线.这种方法对同一样品要求计数几次取平均值,不但操作繁琐、费时,更主要的是误差较大,可达到20%～30%[1],包括取样误差、计数误差等.为了能简便、准确地测定细胞数,我们建立了基于M T T比色法的细胞生长曲线制作方法.
1 材料和方法
1.1 试剂 R P M I1640培养基为G I BCO公司产品,小牛血清为杭州四季青产品,M T T为SERV E产品,其它试剂均为国产.
1.2 仪器 HL22029P型酶标自动分析仪为国营二六二厂产品,P rofile ,E lite型流式细胞仪为美国COUL T ER 公司产品.
1.3 细胞培养 选用人乳腺癌细胞系SK2BR23.细胞培养在含10%小牛血清的R P M I1640培养基中,37℃,5% CO
2.
1.4 镜下计数测定细胞数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,用计数板按常规方法在倒置显微镜下计数,每个样品测三次,取平均值.
1.5 流式细胞仪计数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,取0.2m l细胞过滤后用流式细胞仪自动计数.
1.6 M T T比色法计数 M T T比色法计数为间接计数,先要做出细胞的标准曲线,然后根据欲测样品的A值计算出相应的细胞数.
1.6.1 制作标准曲线 准备细胞悬液,从1×107细胞 200Λl 孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞 孔,每个稀释度三孔细胞,培养板置37℃培养4h后细胞贴壁,每孔中加入20Λg M T T继续培养4h,然后吸出150Λl培养液,加入等量DM SO,37℃20m in,570nm处测定吸光度[2],用二六二厂酶标自动分析仪程序绘出细胞标准浓度曲线.
1.6.2 制作生长曲线 调整细胞的浓度,按2×103 孔接种在96孔板中,置37℃培养,每天用M T T比色法测定3孔细胞的A值,在标准曲线上计算出相应的细胞数,即可绘出细胞的生长曲线.
郝新保,男,32岁,讲师,主治医师2 结果
2.1 细胞数与A值的标准曲线 根据各稀释度的A值制作细胞浓度的标准曲线,
如图1.
图1 SK2BR23细胞浓度的标准曲线
2.2 肿瘤细胞的M T T比色法生长曲线 根据每天测定的三孔细胞的A值在标准曲线上求得其对应的细胞数,7～10d
后即可绘制细胞生长曲线,如图2.
图2 SK2BR23细胞的生长曲线
2×;--0.2×;…20×.
2.3 细胞接种密度对生长曲线的影响 当细胞接种密度较低(2×102 孔)和较高(2×104 孔)时,对细胞生长曲线的形状有一定的影响,如图2.
2.4 M T T比色法与镜下计数法及流式细胞仪计数法的比较 为了比较M T T比色法和镜下计数法制作的细胞生长曲线,用流式细胞仪的计数结果作为参照,结果表明M T T 比色法与流式细胞仪计数结果更接近,明显优于镜下计数法的结果.
3 讨论 从结果可以看出,用M T T比色法制作细胞生长
曲线完全可行.因其减少了取样和计数误差,免除了贴壁细胞的消化等,使其具有简便、快速的特点.对几种不同方法制作的生长曲线进行比较发现,M T T 比色法在客观性上也比镜下计数法有了很大的提高.要掌握好这个方法首要的一点是标准曲线的制作,稀释一定要准确,在保证标准曲线如实反映细胞数的基础上,才能制作出好的生长曲线.
在测定时,接种细胞的密度对生长曲线的影响较大.从图2可以看出,接种密度过高或过低都不利于生长曲线的制作,这与细胞的生长能力有关,可进行简单的预实验确定,一般在(1～5)×103细胞 孔为好.
尽管M T T 比色法测定细胞生长曲线具有很多优点,
但因其需要使用自动酶标仪而受到了一定的限制,如果能开发出细胞生长曲线专用软件,就能摆脱自动酶标仪的限制,利用普通酶标仪就可以开展工作了.参考文献
1鄂 征.组织培养技术.第2版.北京:人民卫生出版社,1993:154
2候 健,孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志,1993;16(4):208～210
(收稿1996-09-17 修回1997-02-04)
编辑 王小仲
化云宁滴眼液的质控标准
王 颖 雷其云 蒋永培 樊亚萱 (第四军医大学西京医院药局 西安710033)
关键词 化云宁 钾离子 耐缺氧 质量控制 刺激性中图号 R 289
我院研制的新药化云宁滴眼液为一复方中药制剂,具有活血化瘀、退翳明目的功效,是治疗角膜瘢痕(角膜云翳,角膜斑翳)的理想药物.在化云宁研制和生产的质量控制上,我们采用了钾离子(K +)含量测定、刺激性实验及生物检定方法作为质控标准,保证了化云宁滴眼液在临床上安全和有效地使用.
1 材料和方法
1.1 药物与试剂 化云宁滴眼液由丹参、黄芩和金银花
等生药的提取液按眼药常规要求制备而成;心得安注射液
(1m g m l ,批号830706,北京制药厂);丹参素注射液(10m g m l ,批号820401,上海医科大学附属中山医院制);生
理盐水(2m l 支,批号8303023,自制).
1.2 实验动物 BALB c 小鼠,雄性,6
～8周龄,体重18～21g ;新西兰白兔2只,雄性,编号分别为543,554,体重分别为2.05kg 和2.45kg (以上动物均由本校实验动物研究中心提供).
1.3 K +含量测定[1] 用System E 4A 型火焰光度计(美国BECK M AN 公司制造)分别测定化云宁滴眼液成品及其组
方中各味药的提取液(丹参,黄芩,金银花等)中K +浓度.样品在测定前均用N aOH 调pH 值至6.8～7.0.
1.4 刺激性实验 采用家兔滴眼法.选取健康新西兰白
兔2只,编号分别为543,554,用药前,检察兔眼结膜血管、角膜透明度等均属正常,如①结膜无血丝及发红;②
王 颖,女,42岁,主管药师
角膜不浑浊,呈透明状;③眼角无分泌物.左眼点化云宁滴眼液2滴(批号850619),右眼点生理盐水2滴作为对照,用药后开始记录时间,并观察眼部反应情况.结果判定以上述用药前检察的①～③项指标无异常为无刺激症状表现
(-),否则为被检眼药有刺激性(+).
1.5 常压耐缺氧实验 按表2中的剂量,小鼠腹腔(注射)
给药(批号830509,自制)后30m in ,放入容量为250m l 的磨口玻璃瓶中,瓶内放钠石灰5g ,每瓶放小鼠一只,放入后用凡士林密封盖紧,并开始记录其存活时间[2].以生理盐水组为对照,比较各组间统计学上的差异,统计学处理采用t 检验.
2 结果
2.1 药液中K +浓度的测定 在中药滴眼液与中药注射液
中常含有来源于植物药材本身的K +,其浓度过高可引起局部疼痛.我们采用中草药注射液的K +浓度限定范围[40%～60%(m g m l )以下][3]做为化云宁滴眼液的质控标准之一.六个批号的化云宁滴眼液中K +浓度测定的结果见表1,均符合限定标准.此外,对化云宁滴眼液中丹参,黄芩和金银花三种主药提取液的K +浓度也分别进行了检测,结果(三次测定的平均值)分别为47.6%,0.8%和
1.2%(m g m l ),由此可见,该滴眼液中的K +主要来源于
丹参.
2.2 刺激性实验 经2只新西兰白兔左、右眼对照实验观
察,除1只兔左眼在用药液后15m in 时观察有轻度流泪外,其余均无任何刺激性反应.因此,该眼药符合有关规定.。