MTT法检测淋巴细胞
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。
MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。
MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。
甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。
MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。
MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。
2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。
3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。
4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。
5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。
然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。
通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。
6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。
7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。
DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。
8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。
总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
MTT法原理步骤
细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
MTT法检测细胞活性的操作方法
MTT法检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。
1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响
MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响摘要：通过MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响，确定棉酚对多浪羊淋巴细胞产生影响的最短作用时间和最低浓度，用于指导生产实践。
从新疆多浪羊外周血分离淋巴细胞，将其加入10 mL的RPMI-1640中，均匀加入96孔细胞培养板中，于CO2 培养箱中37 ℃培养12 h后，分别以不同浓度（5、10、15、20、25、30、35 μmol/L）的棉酚进行作用，作用时间分别为1、2、3、4、5、6 h，加入MTT培养4 h，加入DMSO溶液终止反应，用酶联免疫检测仪于490 nm 处检测各孔的吸光值。
结果表明，随着棉酚作用浓度及作用时间的递增，多浪羊淋巴细胞活性在逐渐下降，说明棉酚对多浪羊的淋巴细胞活性有明显的抑制作用。
关键词：MTT；棉酚；新疆多浪羊；淋巴细胞；影响The Effect of Gossypol on Lymphocyte Growth of Duolang Sheep by MTTAbstract：The effect of gossypol on the growth of Duolang sheep lymphocyte was detected by MTT assay. The object was to determine the shortest time and lowest concentration of gossypol on lymphocyte，and then used to practice. The lymphocyte was isolated from the peripheral blood of Xinjiang Duolang sheep，then added into 10 mL RPMI-1640 and even allocated to 96-well cell culture plate. After cultured in CO2 incubator at 37 ℃for 12 h，the lymphocytes were treated with gossypol of different concentrations （5，10，15，20，25，30，35 μmol/L）for 1，2，3，4，5，6 h，and then added MTT to culture 4 h. At last the reaction was stopped by adding DMSO solution. The absorbance of each well was detected by ELISA at OD490 nm . The results showed that the activity of Duolang sheep lymphocytes decreased with the increase of gossypol concentration and acting time. It indicated that gossypol had obvious inhibitory effect on the Xinjiang Duolang sheep lymphocytes.Key words：MTT；gossypol；Xinjiang Duolang sheep；lymphocyte；effect棉酚（Gossypol，GL）存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，曾作为男性节育药为人们所熟知[1]。
mtt试验原理
mtt试验原理MTT试验原理MTT试验是一种常用的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞生物学研究等领域。
本文将介绍MTT试验的原理及其在科学研究中的应用。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种通过测量细胞线粒体脱氢酶活性来评估细胞代谢活性的方法。
MTT试剂会在细胞内还原为可溶性的紫色产物，通过比色法测定其吸光度，可以间接反映细胞的存活水平。
MTT试验的原理如下：首先，将需要测试的细胞接种在培养基中，使其在恰当的条件下生长繁殖。
然后，将待测物添加到细胞培养物中，不同浓度的待测物可以评估其对细胞的毒性作用。
接下来，在特定的时间点，加入MTT试剂到培养物中，允许其在细胞内转化为紫色产物。
最后，通过溶解细胞并测定溶液的吸光度，可以计算出细胞的存活率。
MTT试验的优势在于其简单、快速、经济，并且可以同时测试多个样品。
通过MTT试验，可以评估药物的毒性、筛选抗肿瘤药物、研究细胞增殖和凋亡等生物学过程。
此外，MTT试验还可以与其他实验方法相结合，如细胞周期分析、细胞迁移实验等，从不同角度全面评估细胞的生理状态。
MTT试验的结果常用半数抑制浓度（IC50）来表示药物的毒性。
IC50值是指药物对细胞生长的抑制作用达到50%所需的浓度。
通过比较不同药物的IC50值，可以评估它们的毒性大小，并选择具有较低毒性的药物进行进一步研究。
然而，MTT试验也存在一些局限性。
首先，MTT试验只能反映细胞的存活水平，无法提供关于细胞死亡机制的详细信息。
其次，MTT 试验对于某些药物或化合物可能存在误差，因此需要结合其他实验方法进行验证。
MTT试验是一种简单快速的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选和细胞生物学研究中。
通过测定细胞存活率，可以评估药物的毒性作用，并为进一步研究提供重要参考。
然而，我们也要意识到MTT试验的局限性，并结合其他实验方法进行综合评估。
MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应的研究
MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应
的研究
张爱莲;金华利;王宾;张富春
【期刊名称】《地方病通报》
【年(卷),期】2004(19)3
【摘要】目的检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠后的细胞免疫水平 ,全面评价牛口蹄疫基因疫苗的免疫效果。
方法采用MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力 ,以期反应出免疫小鼠的细胞免疫应答水平。
结果通过MTT法检测出牛口蹄疫基因疫苗能够激发小鼠的细胞免疫应答。
结论MTT法是检测细胞免疫水平的方法之一。
【总页数】3页(P1-3)
【关键词】牛口蹄疫基因疫苗;T淋巴细胞;增殖反应;MTT比色法
【作者】张爱莲;金华利;王宾;张富春
【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】R535;R-322
【相关文献】
1.MTT法检测蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用 [J], 巢警殳;张岚;杜娟;葛红娟;周涌
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3.MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖试验的心得体会 [J], 魏秋芬;秦啸峰;潘晋
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9.除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放 孵箱15分钟溶解结晶。 10.至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值， 就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选 用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇， 则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
现代应用 实验原理
实验步骤
注意事项
细胞筛 选培养
药物药 效实验
现代 应用
药物毒 性检测
基因工 程
实验原理：
1. MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基 四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 2.检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲臜结晶 ，用酶联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物 活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 淋巴细胞体外转化代表着细胞免疫功能，因此测定 淋巴细胞体外增殖反应是研究细胞免疫功能的重要 手段和指标。
5. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来， 导 致每孔中的细胞数量不等，吹打次数100左右，就可以 吹打均匀了。 6. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹 下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 7. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现 细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆， 一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分 散会产生接触抑制，影响细胞的生长。 8. 96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于 具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致 培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同， 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。
1. 接种细胞：用含10％胎小牛血清得1640培养液配成 单个细胞悬液，接种到96孔板，每孔体积 100~200ul. 2. 培养细胞：5%CO2，37℃孵育，培养24-72h（可根 据试验目的和要求决定培养时间）。 3. 呈色：培养24-72h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml， 用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心 后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO， 脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。 4. 比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测 仪上测定各孔光吸收值，记录结果.
影响主要因素：
影响淋巴细胞增殖反应的因素很多，主要是淋巴细胞 浓度、培养时间、分裂原浓度。 淋巴细胞浓度：103~107 培养时间：24h~72h 抗原刺激物浓度:5~25ul 淋巴细胞分裂原： 检测T淋巴细胞增殖：刀豆蛋白A(ConA)或植物血凝素 （PHA） 检测B淋巴细胞增殖: 脂多糖(LPS)
测细胞相对数和相对活力，但不 能测定细胞绝对数。 2. MTT一般最好现用现配，一般称取MTT0.5g，溶于 100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中， 配制成5mg/ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的 细菌，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小 剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免 分解。MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 3. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种 透明的簿膜手套。 4. 做MTT时，尽量无菌操作，因为MTT对菌很敏感， 细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。