第五章 固定化酶
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第五章酶固定化
Chapter 5 The immobile of Enzyme，Cell and
Protoplast 酶、细胞、原生质体固定化
第五章酶固定化
游离酶的缺点
➢ 酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活 ➢ 酶不易回收利用（酶的一次性使用） ➢ 产物不易分纯，且难连续化生产 ➢ 酶的催化效率不够高
第五章酶固定化
下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。
步骤 step
粗酶 乙醇沉淀
总体积 Volume
(ml)
1040 90
总活力 Total activity (u)
460070
142574
DEAE-
11
Sepharos
e柱层析
HiTrap- 19 Q柱层析
46629 42218
总蛋白 Total protein (mg)
➢ 酶的固定化步骤： （1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下 保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出 后用水冲去污物，用吸水纸吸干。 （2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用水洗至pH值中性。 （3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。
3）产物性质对最适pH的影响； ➢ 产物酸性，其最适pH↑。 ➢ 产物碱性，其最适pH↓。 ➢ 产物中性，其最适pH不变。
第五章酶固定化
（5）底物特异性——发生改变 ➢ 对作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异
性没有明显变化； ➢ 对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物
的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 ➢ 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位
Protoplast 酶、细胞、原生质体固定化
第五章酶固定化
游离酶的缺点
➢ 酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活 ➢ 酶不易回收利用（酶的一次性使用） ➢ 产物不易分纯，且难连续化生产 ➢ 酶的催化效率不够高
第五章酶固定化
下表是某酶的纯化总结表，试计算比活力，回收率及纯化倍数。
步骤 step
粗酶 乙醇沉淀
总体积 Volume
(ml)
1040 90
总活力 Total activity (u)
460070
142574
DEAE-
11
Sepharos
e柱层析
HiTrap- 19 Q柱层析
46629 42218
总蛋白 Total protein (mg)
➢ 酶的固定化步骤： （1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6% CaCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下 保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出 后用水冲去污物，用吸水纸吸干。 （2）将尼龙布用3.65mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用水洗至pH值中性。 （3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20min。
3）产物性质对最适pH的影响； ➢ 产物酸性，其最适pH↑。 ➢ 产物碱性，其最适pH↓。 ➢ 产物中性，其最适pH不变。
第五章酶固定化
（5）底物特异性——发生改变 ➢ 对作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异
性没有明显变化； ➢ 对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物
的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 ➢ 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位
第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
固定化酶
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
固定化
间歇
吸附
包埋
间歇
交联
化学偶联
连续
固定化酶的优缺点
可重复使用
可以装塔连续反应
优点： 纯化简单，易与产物分离
提高产物质量
应用范围广
固定化过程中酶易失活
缺点： 首次投入成本高
大分子底物较困难
二、固定化酶的性质及其影响因素
常用于固定化酶的交联剂 交联剂 戊二醛 二重氮联苯胺－2，2‘－二磺酸 4，4‘－二氟－3，3’－二硝基二苯砜 二苯基－4，4‘－二硫氰酸－2，2’－二磺酸 1，5－二氟－2，4－二硝基苯 酚－2，4－二磺酰氯 3－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二异氰酸盐
酶共价交联有2种形式： 酶直接交联法 酶辅助蛋白交联
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
辅酶固定化的方法：
固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚 胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当 的化学修饰后固定在超滤器中。
这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性 好。
5、共价偶联法
图 7－11 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
《酶的固定化》课件
稳定性等
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
第五章固定化酶和细胞
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
第五章 固定化酶讲解
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
第五章酶的固定化ppt课件
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
三 固定化酶的性质
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
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Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme
第三节辅酶的固定化
1.需辅酶的酶的固定化 ① 直接将酶蛋白共价结合于载体，向反应 系统补充辅酶。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第四节细胞的固定化
1.优点： ① 固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然 环境，因而更稳定； ② 省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失， 固定化细的酶发挥作用，也可利用它所 包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过 程，特别适合需要辅助因子参与的合成代谢过程；
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
a. 降低 ：传质限制引起的；微环境的变化 , 也可能导致微生物生长速率降低。
b.增加 ：固定化载体对微生物提供的保护作 用。免受高剪切力的作用 ，限制抑制性底 物的局部浓度
2. 固定化对微生物活性的影响 • 激活代谢活性；提高微生物次级代谢产
物
3.对酶活的影响 由于细胞内环境的相对恒定和细胞的“缓 冲作用”，固定化对细胞内酶产生的影 响在某些方面不象固定化酶那样明显。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
② 将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附 上去；
③ 将酶蛋白和辅酶共固定化； ④ 辅酶直接偶联于酶上制成酶—辅酶络合 物，
2．辅酶的固定化 ① 载体结合法
• 辅酶分子本身具备不参与催化活性的的 功能团；
• 引入适当的功能团（羧基、氨基） ② 包埋法
• 需高分子化。
磷酸吡哆醛的偶联基团
NAD(P)的偶联基团
葡萄糖酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß －D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2
Glucose Membrane
Glucose oxidase Oxygen
Gluconic acid Hydrogen peroxide
Electrode
根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量， 可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含 量。
巯基和咪唑基等。
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μmol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%
• Fig. 4. Effect of pH on the (A) activity and (B) stability of the free and immobilized ROL. Enzymes activities were assayed at 37 °C using 10 ml olive oil emulsion as substrate.Enzymes were incubated 1 h at different pH for stability study.
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与宏观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
3．辅酶物质的再生及偶联酶系的固定化 ①独立进行形式
• ②共组合形式
图5．5(A)是由苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和 柠檬酸缩和酶(CS)组成的NAD+—NADH再生偶联酶系统； 图5．5(B)是由乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)组 成的ADP—ATP再生偶联酶系统。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
第五节：固定化酶（细胞）的应用
（一）固定化酶在工农业生产上的应用
（二）固定化酶在医药治疗上的应用
（三）固定化酶在分析化学中的应用
• 酶法分析：是以酶作为分析工具或分析 试剂，用以测定样品。
• 酶传感器：将酶与电化学传感器相连接 来测定底物浓度的电极，也称为酶电极。
酶传感器工作原理示意图
酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质 发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电 信号，通过仪表显示出来。
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
加入蛋白量
偶联效率
加入总活力 - 溶液中残留活力 加入总活力
100 %
三、活力回收和相对活力
• 活力回收：固定化酶活力占溶液酶活力 的百分数
活力回收
固定化酶活力 溶液酶活力 100%
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量 的溶液酶活力的比值
相对活力
固定化酶活力 溶液酶总活力 残留酶活力
100 %
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
④缩短了发酵生产周期,固定化细胞的密度 大，；
⑤稳定性好，可以较长时间反复使用或连 续使用；
⑥发酵液中含菌体较少，有利于产品分离 纯化，提高产品质量。
2.局限性：
① 利用的仅是胞内酶； ② 细胞内多种酶的存在，会形成不需要的
副产物； ③ 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限
第三节辅酶的固定化
1.需辅酶的酶的固定化 ① 直接将酶蛋白共价结合于载体，向反应 系统补充辅酶。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第四节细胞的固定化
1.优点： ① 固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然 环境，因而更稳定； ② 省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失， 固定化细的酶发挥作用，也可利用它所 包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过 程，特别适合需要辅助因子参与的合成代谢过程；
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
a. 降低 ：传质限制引起的；微环境的变化 , 也可能导致微生物生长速率降低。
b.增加 ：固定化载体对微生物提供的保护作 用。免受高剪切力的作用 ，限制抑制性底 物的局部浓度
2. 固定化对微生物活性的影响 • 激活代谢活性；提高微生物次级代谢产
物
3.对酶活的影响 由于细胞内环境的相对恒定和细胞的“缓 冲作用”，固定化对细胞内酶产生的影 响在某些方面不象固定化酶那样明显。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
② 将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附 上去；
③ 将酶蛋白和辅酶共固定化； ④ 辅酶直接偶联于酶上制成酶—辅酶络合 物，
2．辅酶的固定化 ① 载体结合法
• 辅酶分子本身具备不参与催化活性的的 功能团；
• 引入适当的功能团（羧基、氨基） ② 包埋法
• 需高分子化。
磷酸吡哆醛的偶联基团
NAD(P)的偶联基团
葡萄糖酶电极
半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß －D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2
Glucose Membrane
Glucose oxidase Oxygen
Gluconic acid Hydrogen peroxide
Electrode
根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量， 可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含 量。
巯基和咪唑基等。
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μmol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%
• Fig. 4. Effect of pH on the (A) activity and (B) stability of the free and immobilized ROL. Enzymes activities were assayed at 37 °C using 10 ml olive oil emulsion as substrate.Enzymes were incubated 1 h at different pH for stability study.
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与宏观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
3．辅酶物质的再生及偶联酶系的固定化 ①独立进行形式
• ②共组合形式
图5．5(A)是由苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和 柠檬酸缩和酶(CS)组成的NAD+—NADH再生偶联酶系统； 图5．5(B)是由乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)组 成的ADP—ATP再生偶联酶系统。
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
第五节：固定化酶（细胞）的应用
（一）固定化酶在工农业生产上的应用
（二）固定化酶在医药治疗上的应用
（三）固定化酶在分析化学中的应用
• 酶法分析：是以酶作为分析工具或分析 试剂，用以测定样品。
• 酶传感器：将酶与电化学传感器相连接 来测定底物浓度的电极，也称为酶电极。
酶传感器工作原理示意图
酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质 发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电 信号，通过仪表显示出来。
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
加入蛋白量
偶联效率
加入总活力 - 溶液中残留活力 加入总活力
100 %
三、活力回收和相对活力
• 活力回收：固定化酶活力占溶液酶活力 的百分数
活力回收
固定化酶活力 溶液酶活力 100%
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量 的溶液酶活力的比值
相对活力
固定化酶活力 溶液酶总活力 残留酶活力
100 %
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
④缩短了发酵生产周期,固定化细胞的密度 大，；
⑤稳定性好，可以较长时间反复使用或连 续使用；
⑥发酵液中含菌体较少，有利于产品分离 纯化，提高产品质量。
2.局限性：
① 利用的仅是胞内酶； ② 细胞内多种酶的存在，会形成不需要的
副产物； ③ 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限