各种酶固定方法
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。
这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
酶的固定化方法
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酶的固定化方法
酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。
根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。
物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。
离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。
共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。
交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。
前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。
清华同方教育技术研究院。
固定化酶的化学制备方法
固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。
固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。
第一种是物理固定化法。
这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。
常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。
吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。
沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。
共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。
第二种是化学固定化法。
这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。
选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。
交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。
第三种是生物固定化法。
生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。
这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。
以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。
在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。
酶的固定化技术
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CON3 +E-SH R-O-CH2 –CO-S-E
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
酶的固定化技术
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
酶的固定化技术
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
酶的固定化技术
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
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一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。
2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。
称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环泵中,搅拌器搅拌反应 24h。
过滤,测定上清液的蛋白质含量。
抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。
三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。
2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。
称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。
3、果糖转移酶的固定化方法用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。
交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫泡待用。
4、酶活测定方法游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。
5、惰组分测定方法采用 HPLC( 高效液相色谱)法。
HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。
6、酶活力定义每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。
酶用量为 2U/g 蔗糖。
固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法。
固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。
四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定1、海因酶的制备将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。
蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C下保存备用。
2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3• H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。
以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。
3、 EDC 溶液的配置称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。
4、环氧基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。
4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。
5、氨基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。
反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。
五、黑曲霉果胶酯酶固定化1、游离酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kerte钮， 1937 )测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑桶果胶溶液于 40 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到 4 .4，加入lmL 酶液(稀释 10 倍) ，同时开始记时。
果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人 O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在4 .4。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应5min ，以加人的NaOH 的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1 个酶活单位 :40 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即PE 活力单位是μmol/min 。
2、固定化酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kertesz , 1937) 测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑情果胶溶液于 45 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到固定化果胶醋酶的最适 pH( 明胶固定化果胶醋酶为 4.0 、蛋壳固定化果胶醋酶为 4.2) ，加人一定量的固定化果胶醋酶(明胶固定化果胶醋酶为 8g 、蛋壳固定化果胶醋酶为 1g) ，同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在固定化果胶醋酶的最适 pH 。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应 5min ，以加人的 NaOH 的微摩尔数反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1个酶活单位: 45 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE 活力单位是μmol/min。
3、固定化酶的制作方法蛋壳固定化酶的制作方法蛋壳的预处理取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。
用去离子水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于干燥箱内 60 °C干燥数小时，研成小颗粒，待用。
蛋壳的酸处理称取与预处理好的蛋壳于100mL 烧杯中，向其中缓慢加人 50mL pH = 1. 0 的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理 24h ，最终pH =4 。
固定化酶的制备称取 1g 酸处理后干燥的蛋壳，加入 9mL 乙酸-乙酸铀 (pH = 4.5) 缓冲液，再加入稀释 10 倍的黑由霉果胶醋酶 lmL( 酶活力60U) ，在 4°C (冰水温合物中)搅拌 2-3 h，使其充分吸附在蛋壳上。
之后对其进行离心 (4 °C , 5000*g , 20min) ，得到的离心沉淀产物即为固定化果胶醋酶，用乙酸一乙酸铀 (pH4.5 )缓冲液洗涤数次，放在冰箱中 (4 °C)保存备用。