实验六 甘草中总黄酮的提取和检测
甘草中金属元素与总黄酮含量测定与抗氧化研究
第28卷,第3期光 谱 实 验 室Vol.28,No.3 2011年5月Chinese J ournal of Sp ectroscop y L abor atory May,2011甘草中金属元素与总黄酮含量测定与抗氧化研究张雷 韩丽琴 a 董顺福a 刘建华a(吉林医药学院附属医院 吉林省吉林市华山路81号 132013)a(吉林医药学院化学教研室 吉林省吉林市吉林大街5号 132013)摘 要 对中草药甘草中金属元素与总黄酮含量进行测定,并对其清除超氧自由基进行研究。
测定结果显示,甘草中含有丰富的金属元素和黄酮类化合物,其中总黄酮为16.42%,金属元素含量为铁>锌>锰>铜,对超氧自由基具有一定的清除作用。
实验结果为研究甘草治疗呼吸系统疾病及清除自由基提供了有用的数据。
关键词 甘草;总黄酮;金属元素;抗氧化中图分类号:O657.31;O657.32 文献标识码:A 文章编号:1004-8138(2011)03-1258-031 引言甘草为豆科甘草属植物,是常用中药之一。
近年来研究发现,甘草黄酮类化合物具有抑菌、抗真菌、增强机体免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、保肝等广泛的药理作用[1]。
为探讨甘草中总黄酮的相关作用及其与治疗呼吸系统疾病的功效关系,对甘草中金属元素和总黄酮进行测定及抗氧化研究。
2 实验部分2.1 试剂与仪器甘草,市售。
HNO3,HClO4均为优级纯;M g、M n、Zn、Fe标准储备液(国家标准溶液,浓度为1mg·mL-1,国家钢铁材料测试中心);使用液:Cu为50 g·mL-1;Mn、Zn、Fe均为50 g·mL-1;芦丁标准品(F20050930,北京国药集团化学试剂有限公司)。
其他试剂均为分析纯。
实验用水为去离子高纯水(R>106 )。
HG-9600A型原子吸收分光光度计(沈阳分析仪器厂),附80586计算机及FAAS软件处理系统;UV-1200型紫外分光光度计(北京分析仪器厂)。
甘草有效成分的提取分离实验方案
甘草有效成分的提取分离实验方案实验目的：通过对甘草中甘草黄酮、甘草酸和甘草多糖的提取分离，进一步理解他们的理化性质，并且初步掌握提取分离的方法。
实验原理：黄酮类化合物则泛指两个苯环（A环与B环）通过中央三碳相互联接而成的一系列化合物。
根据中央三碳的氧化程度、是否成环、B 环的联接位点等特点，可将该类化合物分为多种结构类型。
代表化合物有甘草黄酮、甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙、甘草查尔酮等。
甘草中已经发现的黄酮类化合物有一百多种，本实验只对其进行粗提，并且测定其总含量。
甘草酸是一类三萜类皂苷，主要以甘草酸钾、钙盐的形式存在，是甘草次酸的二葡萄糖醛酸甙，含量在4-20%之间；甘草酸水解脱去糖酸链变形成了甘草次酸。
超临界CO2萃取甘草总黄酮的萃取率是1. 35%，含量32. 45%，是索氏提取法提取甘草总黄酮的提取率的2.2倍，索氏提取溶剂用量是超临界CO2萃取的6倍。
本实验采取超临界CO2萃取法提取甘草黄酮。
【1】大孔树脂适于物质水溶液的分离纯化，超临界C02萃取提取的甘草总黄酮中乙醇含量过高，即使对萃取液进行浓缩处理，其中乙醇的含量仍然很高，所以大孔树脂的吸附、解吸附的效果不好。
萃取液浓缩近干加入水后，所要分离的物质析出变混浊，也不适合用大孔树脂进行分离纯化。
与大孔树脂层析比较，硅胶柱层析可以更有效的分离纯化甘草黄酮。
使用硅胶柱层析可以有效地使甘草黄酮类物质的含量达到55%以上，收率1. 12%，符合国家中药二类新药的原料要求。
【1】综合考虑，本实验选择硅胶柱层析对甘草黄酮进行分离纯化。
甘草酸和甘草次酸的极性比黄酮类物质的极性大，更易溶于极性大的低浓度乙醇中，采用85%乙醇作为夹带剂，使得在二氧化碳超临界萃取甘草黄酮类物质过程中，大部分甘草酸和甘草多糖仍然留在残渣中。
鉴于甘草酸和甘草多糖都溶于水的性质，本实验采用超声或微波辅助法对它们同时进行提取[3]。
对于提取后的甘草酸和甘草多糖的分离，可查阅到的方法包括醇沉酸沉法[3]。
甘草超滤液中总黄酮络合萃取
甘草超滤液中总黄酮络合萃取目录一、项目背景与研究目的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21.项目背景介绍．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32.研究目的及意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3二、甘草超滤液的制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41.甘草原料的选取与处理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52.超滤膜的选择及预处理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．53.超滤操作过程与参数设置．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6三、总黄酮的络合萃取原理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．71.总黄酮的概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82.络合萃取原理介绍．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．83.适用于甘草超滤液的萃取剂选择．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9四、实验材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．101.实验材料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11（1）甘草超滤液．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12 （2）萃取剂及其他试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．132.实验方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14（1）总黄酮含量的测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14 （2）络合萃取实验操作．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15五、实验结果分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．161.总黄酮萃取率的测定结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．172.不同条件下萃取效果的比较．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18（1）不同萃取剂浓度的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19（2）不同萃取温度的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20六、讨论与优化建议．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．211.实验结果的讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22（1）实验数据与理论预期的对比．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23（2）实验过程中可能存在的误差分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．232.对实验操作的优化建议．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24（1）针对实验条件的优化建议．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25（2）针对实验流程的优化建议．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27七、结论与展望．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28一、项目背景与研究目的（一）项目背景甘草，学名Glycyrrhiza uralensis，是一种在传统中医药中广泛使用的草药，其根部被广泛应用于缓解喉咙痛、咳嗽、胃溃疡等多种疾病。
实验六 甘草中总黄酮的提取和检测
内
分光光度法测定原理
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图 1 甘草中总黄酮的提取工艺流程图
古
分光光度法既能进行定性又能进行定量测定， 它是根
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技 大
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易行、比较常用的溶剂提取法来进行有效成分的提取。溶剂提取法按其实现方式
量。本实验选用为芦丁标准品（纯度大于95%） 。
图 2 铝离子与黄酮形成的络合物结构 Fig.2 Structures of Al3+-flavone complexes
实验六
一、实验目的和要求
甘草中总黄酮的提取和检测
1．熟悉甘草中总黄酮的提取方法和工艺； 2．掌握分光光度法测定物质含量的方法。 二、实验原理 甘草黄酮是从特定品种甘草中提取的天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶的活 性，又能抑制多巴色素互变和 DHICA 氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色 的美白祛斑化妆品添加剂。 甘草黄酮易溶于有机溶剂， 根据活性成分的特性，本实验主要采用了简单
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6 提取液 甘草中总黄酮的含量
5.0 —— 总黄酮的重量 100% 银杏叶的干重
1.0 ——
思 考 题
1．所示回流提取法的原理是什么? 2．分光光度法测定的原理是什么? 3．造成实验测得总黄酮含量偏低的原因有哪些?
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古Leabharlann 科技 大学
滤纸包好， 置于 500mL 索氏提取器中， 加入 400mL 无水乙醇提取至流出液无色， 大约 4h 后取出提取液，自然冷却备用。 2．甘草中总黄酮的测定 (1)标准溶液的配制 将芦丁标准品于 120℃下干燥至恒重，精确称取芦丁标准品 10.00mg 置于
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技 大
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50mL 容量瓶中， 加入适量 60%乙醇溶液， 在 50℃的水浴中加热溶解， 自然冷却， 用 60%乙醇溶液定容至刻度，即得浓度为 0.20mg/mL 的芦丁标准溶液。 (2)标准曲线的制作 取 10 mL 具塞比色管 6 支，分别准确吸取芦丁标准溶液 0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于 10 mL 具塞比色管中。然后各加入 30%乙醇补 充至 5.0 mL，加入 5%的 NaNO2 溶液 0.6mL，摇匀，放置 6min 后加入 10%的 Al （NO3） 摇匀， 再放置 6min， 加入 1mol/LNaOH 溶液 4mL， 用 30% 3 溶液 0.6mL， 乙醇定容，摇匀，放置 15min。在紫外-可见光分光光度计上，先取两个 1cm 比 色皿加空白溶液，在 510nm 波长处调零。取出一个比色皿，加入不同浓度的溶 液，再在 510nm 波长处测定吸光度 A。以黄酮含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐 标，绘制标准曲线。 (3)甘草提取液中总黄酮含量的测定
甘草提取黄铜实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习甘草中黄酮类化合物的提取方法，通过溶剂提取、分离纯化等步骤，获得甘草黄酮粗品，并对其理化性质进行初步分析。
二、实验原理甘草中含有丰富的黄酮类化合物，具有多种生物活性。
本实验采用溶剂提取法，利用有机溶剂（如甲醇、乙醇等）提取甘草中的黄酮类化合物，再通过有机溶剂萃取、浓缩等步骤进行分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：甘草粉末（市售）甲醇（分析纯）乙醇（分析纯）氯仿（分析纯）碳酸氢钠（分析纯）石英砂烧杯蒸馏装置漏斗滤纸烧瓶恒温水浴锅紫外-可见分光光度计2. 实验仪器：上述实验材料所列仪器四、实验步骤1. 甘草粉末的制备：将甘草粉末过筛，取40目筛的粉末备用。
2. 甘草黄酮的提取：（1）取10g甘草粉末，加入100mL甲醇，在恒温水浴锅中回流提取2小时。
（2）提取液过滤，滤液浓缩至约10mL。
3. 甘草黄酮的分离纯化：（1）将浓缩液转移至分液漏斗中，加入等体积的氯仿，充分振荡，静置分层。
（2）分取氯仿层，加入5g碳酸氢钠，充分振荡，静置分层。
（3）分取水层，用氯仿萃取2次，合并氯仿层。
（4）将氯仿层浓缩至约1mL，加入适量乙醇，溶解，转移至50mL容量瓶中，用乙醇定容。
4. 甘草黄酮的鉴定：（1）取适量甘草黄酮溶液，在紫外-可见分光光度计上测定其吸收光谱。
（2）与标准黄酮溶液进行比较，确定甘草黄酮的吸收峰。
五、实验结果与分析1. 甘草黄酮的提取率：根据实验结果，甘草黄酮的提取率为1.5%。
2. 甘草黄酮的理化性质：（1）甘草黄酮的吸收光谱：在紫外-可见分光光度计上，甘草黄酮的吸收峰位于278nm和355nm。
（2）甘草黄酮的性状：甘草黄酮为黄色粉末，无臭，味苦。
六、实验讨论本实验采用溶剂提取法提取甘草黄酮，操作简便，提取率较高。
通过有机溶剂萃取、浓缩等步骤，可获得较纯的甘草黄酮粗品。
实验结果表明，甘草黄酮具有良好的理化性质，具有进一步研究开发的潜力。
七、实验总结本实验成功地从甘草中提取了黄酮类化合物，并对甘草黄酮的理化性质进行了初步分析。
甘草中黄酮的纯化方法和含量测定
甘草中黄酮的纯化方法和含量测定
李俊松;徐德生;冯怡;陈丽华
【期刊名称】《中成药》
【年(卷),期】2007(029)007
【摘要】目的:研究聚酰胺富集甘草中黄酮的工艺参数,同时建立其含量测定方法.方法:以二氢黄酮类化合物在碱性条件下转化为查尔酮类的量作为指标,以柚皮苷为对照品,经聚酰胺吸附柱富集后,采用碱性比色法显色、测定.结果:纯化工艺条件为甘草聚酰胺比2:1(g/g),树脂径高比1:7,用5倍量柱体积70%乙醇洗脱,甘草黄酮洗脱率在90%左右;含量测定平均加样回收率为98.81%(RSD=2.00%).总固物中黄酮含量可达45%.结论:本法富集、纯化甘草总黄酮可行;甘草黄酮含量测定方法稳定,可靠.
【总页数】4页(P997-1000)
【作者】李俊松;徐德生;冯怡;陈丽华
【作者单位】上海中医药大学,上海,201203;上海中医药大学,上海,201203;上海中医药大学,上海,201203;上海中医药大学,上海,201203
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
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文全
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4.甘草细胞培养物黄酮含量测定方法的建立 [J], 王磊;杨英;周圆圆;敖明章;余龙江
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甘草总黄酮的微波提取及含量测定
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作者简介: 孙 萍 (19662) , 女 (汉族) , 江苏靖江人, 现任石河子大学师范
5 6
学院讲师, 主要从事微波技术在药物合成提取中的应用研究.
0. 200 0. 200 0. 200
0. 370 5 0. 369 7 0. 368 4
99. 20 98. 80 98. 15
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© 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
时珍国医国药 2003 年第 14 卷第 5 期
L ISH IZH EN M ED IC IN E AND M A T ER IA M ED ICA R ESEA RCH 2003 VOL. 14 NO. 5
甘草总黄酮的微波提取及含量测定
孙 萍1, 李 艳1, 成玉怀2
(1. 石河子大学师范学院, 新疆 石河子 832002; 2. 石河子大学药学院, 新疆 石河子 832002)
1999, 30 (8) : 5892589. [ 7 ] 韩公羽, 沈企华. 植物药有效成分的研究与开发[M ]. 杭州: 杭州大
学出版社, 1991: 942102.
( 临床报道(
桂枝茯苓胶囊治疗药物流产后子宫出血 90 例
种丽群
(江苏省常州市中医医院 213003)
摘要: 目的: 观察桂枝茯苓胶囊对药物流产后子宫出血的疗效。方法: 在用米非司酮做药物流产 180 例中, 随机选取 90 例
G ly cy rrh iz a g labra L. by M icrow ave techn ique, and determ in te the con tea t w ith co lo rim etry. Results: T he ch rom oco con ten t of G ly cy rrh iz a g labra L. is 1. 721% , recovery ra te is 98. 26%. Conclusion:M icrow ave T echn ique is first app lied in ex tracting ch rom oco of G ly cy rrh iz a g labra L. T he reaction sp eed is fa ster and the resu lt is sa tisfacto ry.
甘草总黄酮和总皂苷成分的提取工艺及其含量分析
２ １２标准曲线 的制备 黄酮标准 曲线 ：精 密吸取 ．． 甘草 苷储备 液 ００ ，０ １ ． ，０４ ． ， ．ｍ ．５ ． ，０２ ． ，０ ６ ０ ８ Ｌ 依 次置 于 １ ｍ ０ Ｌ的容 量 瓶 中 ，各 加 入 ７ ％ 甲 醇溶 液 ０
［ 基金项 目］ 国家 自然科学基金项 目（０ ７ ３８ ； ３ ５２ ２ ） 高等学校博 士点科研基金项 目（０ ５０ ６ ０ ） ２ ００ ２ ０６ ［ 通讯作者 ］
药 材 质量 。
［ 关键词 ］ 甘草 ；总黄酮 ；总皂苷 ；正交试验 ；含 量测定
甘草是 常用 中药材 ，具有 补 脾益 气 ，清热解 毒 ， 祛痰 止咳 ，缓 急止 痛 ，调 和诸 药 的功能 ¨ ，在 医疗 、 食 品 、化妆 品 等行 业 中的 应用 广 泛 。甘 草 黄 酮 和皂 苷是基 本结构 不 同 的两类 化 合 物 ，也 是 甘 草具 有 多 种药 理作用 的物质 基础 ，在甘 草药 材 中的含 量较 高 ， 但在不 同 品种 、不 同产 地 甘 草药 材 中 的含量 差 异 较
大 ，以往测定 甘 草 总黄 酮 和 总皂 苷 含 量 常 以不 同 的
醋酸 、高氯 酸等试 剂均 为分析 纯 。
不 同 品 种 和 不 同 产 地 野 生 甘 草 药 材 ，甘 草
Ｇｙｙｒｉ ｒｌ ｓ ｉ ｈ 集 自西 北 地 区 （ 疆 、 ｌｃｒ ｚ ｕａｅ ￣Ｆｓ ．采 ｈａ ｎ ｃ 新 甘 肃） ，中西 部地 区 （ 内蒙古 、 宁夏 、陕 西 ） ，东 北地 区 （ 林 、 龙江 ） 等地 ，每 区取样 ５份 ；在 新 疆采 集 吉 黑
甘 草 Ｇｙｙｒｉ ｒｌ ｓ ｉ ｈ 、光果 甘草 Ｇｙｙｒｉ ｌ ｒ ｚ ｕａｅ ｉＦｓ ． ｃ ｈａ ｎｓ ｃ ｌ ｒ ｚ ｃ ｈａ
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据物质对紫外区域的光或可见光的选择吸收性，进行物质定性、定量分析的一种 方法。显色反应的条件有显色剂用量、介质的酸度、显色时溶液的浓度、显色时 间等；测量吸光度的条件包括应选择的入射光波长、吸光度范围和参比溶液等。 用分光光度法测定甘草提取液和提取物中总黄酮含量是目前国内普遍采用方法。 该方法采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，在510nm波长处测定。 其基本原理是：黄酮母核上3和(或)5位上的H或OH取代时能与铝离子形成络合 物；此外B环上有任何相邻的双羟基时，也能产生络合作用(其形成的络合物结构 如图2所示)，从而在吸收光谱上发生明显变化，可作为定量测定的依据：不同结 构的黄酮类化合物，显色情况不同，因此要选用标准品，可用本法测定总黄酮含
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6 提取液 甘草中总黄酮的含量
5.0 —— 总黄酮的重量 100% 银杏叶的干重
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思 考 题
1．所示回流提取法的原理是什么? 2．分光光度法测定的原理是什么? 3．造成实验测得总黄酮含量偏低的原因有哪些?
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分光光度法测定原理
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图 1 甘草中总黄酮的提取工艺流程图
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分光光度法既能进行定性又能进行定量测定， 它是根
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易行、比较常用的溶剂提取法来进行有效成分的提取。溶剂提取法按其实现方式
量。本实验选用为芦丁标准品（纯度大于95%） 。
图 2 铝离子与黄酮形成的络合物结构 Fig.2 Structures of Al3+-flavone complexes
回流提取装置图
如图 3 所示。
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图 3 索氏提取装置图 Fig.3 Apparatus of Soxhlet extraction
1-铁架台 2-电热套 3-圆底烧瓶 4-冷凝管 5-萃取物料 6-索氏萃取管
三、实验步骤 1.甘草总黄酮的提取 准确称取烘干过 60 目筛子的甘草粉末 3.0g，用精密
和操作工艺的不同，可分为以下几种：a. 浸渍法；b. 渗漉法；c. 煎煮法；d. 回 流提取法等。由于回流提取法是利用易挥发的有机溶剂进行加热提取，并采用冷 却装置使溶剂连续回流，使植物有效成分能充分提出，且此法简单易行，溶剂用 量少，提取较完全，故本实验中采用了索氏回流提取法。 采取索氏回流提取法从甘草中提取总黄酮的工艺流程如图 1 所示。
滤纸包好， 置于 500mL 索氏提取器中， 加入 400mL 无水乙醇提取至流出液无色， 大约 4h 后取出提取液，自然冷却备用。 2．甘草中总黄酮的测定 (1)标准溶液的配制 将芦丁标准品于 120℃下干燥至恒重，精确称取芦丁标准品 10.00mg 置于
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50mL 容量瓶中， 加入适量 60%乙醇溶液， 在 50℃的水浴中加热溶解， 自然冷却， 用 60%乙醇溶液定容至刻度，即得浓度为 0.20mg/mL 的芦丁标准溶液。 (2)标准曲线的制作 取 10 mL 具塞比色管 6 支，分别准确吸取芦丁标准溶液 0.0mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于 10 mL 具塞比色管中。然后各加入 30%乙醇补 充至 5.0 mL，加入 5%的 NaNO2 溶液 0.6mL，摇匀，放置 6min 后加入 10%的 Al （NO3） 摇匀， 再放置 6min， 加入 1mol/LNaOH 溶液 4mL， 用 30% 3 溶液 0.6mL， 乙醇定容，摇匀，放置 15min。在紫外-可见光分光光度计上，先取两个 1cm 比 色皿加空白溶液，在 510nm 波长处调零。取出一个比色皿，加入不同浓度的溶 液，再在 510nm 波长处测定吸光度 A。以黄酮含量为横坐标，吸光度 A 为纵坐 标，绘制标准曲线。 (3)甘草提取液中总黄酮含量的测定
实验六
一、实验目的和要求
甘草中总黄酮的提取和检测
1．熟悉甘草中总黄酮的提取方法和工艺； 2．掌握分光光度法测定物质含量的方法。 二、实验原理 甘草黄酮是从特定品种甘草中提取的天然美白剂，它能抑制酪氨酸酶的活 性，又能抑制多巴色素互变和 DHICA 氧化酶的活性，是一种快速、高效、绿色 的美白祛斑化妆品添加剂。 甘草黄酮易溶于有机溶剂， 根据活性成分的特性，本实验主要采用了简单
或悬浮物不均匀而造成测量结果不准确。 五、实验结果与讨论（见表 1） 表1 样液编号 1 2 3 4 5 标准曲线的绘制与甘草中总黄酮含量的测定 标准溶液的量/ mL 0 1.0 2.0 3.0 4.0 总黄酮含量 0 0.2 0.4 0.6 0.8 吸光度 A
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2．分析过程中，标准液及未知液的配制要充分摇匀和放置，防止因反应不充分
准确移取 1.0mL 提取液，分别置于两支 10mL 具塞比色管中，一支加 30% 乙醇溶液为空白， 另一支按标准曲线方法操作， 并用 30%乙醇定容， 测定吸光度。 由提取液的吸光度值在标准曲线上查出其中总黄酮的含量， 最后计算出甘草中总 黄酮的含量。 四、注意事项
1．由于甘草总黄酮的含量较低，所以在提取中过滤离心定容的移液过程都需要 用乙醇洗三次，否则会造成含量偏低。