亚细胞定位实验protocol

亚细胞定位
Confocus
一、实验材料
玻片，镊子，75%酒精，细胞转染用物品，PBS，4%多聚甲醛，Trixon-X-100，铝箔，摇床，DAPI染色液，荧光封片液，指甲油，载玻片，激光扫描共聚焦显微镜（型号：ZEISS LSM 510 META），光盘
二、实验原理
亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，如胞核，胞浆内，细胞膜或某一特定细胞器上存在。

通常是将目的蛋白与报告基因（如绿色荧光蛋白基因EGFP、红色荧光蛋白基因Dsred等）融合表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光的表达部位从而致使目的蛋白在细胞内的定位。

DAPI，4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种标记细胞核的荧光染料，因其与dsDNA有高度的亲和力，与DNA结合后会发出强烈的荧光。

激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。

普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。

共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。

在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。

三、操作程序与结果判定（结合自己的经验将可能遇到的问题
及解决办法也列出）
1、细胞爬片的处理（24孔板）
细胞爬片可以买专门的爬片（一般直径1cm的正方形玻片正好适合24孔板的大小）用镊子夹取后在酒精灯上过火后轻轻放入细胞板内。

此后再接入适量消化好的细胞。

爬片处理：将玻片放入小烧杯，再加浓硫酸处理。

处理完后，用ddH20洗。

再泡到75%酒精里。

注意: 1、不建议将爬片泡酸后高压灭菌，首先玻片太薄高压容易使玻片变形，其次湿灭很容易使玻片上留下水渍影响细胞贴壁；
2、接细胞时控制合适的细胞量，避免收样时细胞量过度拥挤甚至打堆影响结果的观察。

2、过表达：第一天下午传细胞，第二天下午转染（24h）。

直接转染
1:18传。

内源性：可以密一点1:14。

第一天上午传细胞，第二天上午做。

转染（FUGENE转质粒1:2.5，lipo2000转核酸模拟物1:2）
一般可用293T做一次预实验来确定各个质粒的转染量
16~18h后可加刺激，制片（HSV 2x108 每孔2ul / HSV120 3ug/ml）
要等HeLa细胞贴好后加刺激。

（细胞伸展开）
PS：MLF细胞传细胞时，若可1:5传，则做confocus按1:10传，使孔板里长到40%~50%
3、DAPI染色
PBS：NaCl: 8.00g KCl: 0.20g Na2HPO4 .12H2O: 2.9g KH2PO4: 0.2g
DAPI贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用铝箔包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。

使用时用1*PBS 2000~4000倍稀释。

4%多聚甲醛：将4g多聚甲醛加入80ml PBS中，烘箱里放着即可，直至固体全部溶解，定容至100ml就成为4％的多聚甲醛固定液。

4度避光保存。

（也可用预冷的80%丙酮或100%甲醇代替,但甲醛会腐蚀有机塑料）
1）加刺激4h后可吸取培养基，用PBS洗1次。

（转染后18~20h后收细胞）
2）用预冷的4%多聚甲醛室温固定15~20分钟，吸去上清。

3）用PBS在室温漂洗3次，每次5分钟（液体没过细胞即可，200ul左
右）。

（自带荧光DAPI染色后即可封片，DAPI染色无需打孔剂打孔）
下面是需要抗体的步骤：
4）用含0.1%~0.2%Triton-X-100的PBS在室温穿孔5分钟。

（放在4度或者常温，）
5）吸去上清，加入1%BSA-PBS封闭30min（200ul/孔）
6）加入一抗αF/aHA(1:200配），200ul/孔，用1%BSA-PBS稀释，室温1h
要提前探索稀释比例，可做梯度稀释。

（一抗就是IP的那个一抗）
7）加入1%BSA-PBS洗5次（过表达） 10次（内源性）每次10min
8）加入二抗Alexa-488（绿光）（Donkey anti-Mouse）1:300 1h（用PBS 配）可重复使用一次（Donkey anti-Rabbit 放在共用冰箱下面第一层，滤纸带离的盒子里，一般是分装好的）
9）加入1%BSA-PBS洗（同第七步）
10）加入DAPI染色液室温作用2分钟（时间不能太长，注意避光）PBS 配，要37度预热2~3min（DAPI 1：2000或1:3000配）
11）用PBS洗5次，每次5min
PS：一抗和二抗种属要一致
洗的时候，一手用泵将其抽干，另一手加溶液，保证玻片不干。

4、封片（防淬灭剂：antifade regend 蓝盖棕瓶life 较黏 3ul/片）
荧光封片液： PBS与甘油等体积混合
1)载玻片上做标记后滴一小滴荧光封片液，待用；
2)将1ml注射器针头弯曲，从孔内钩起玻片，用镊子夹出；（可直接用镊
子夹出，前面带个小钩子），要记住细胞面。

用纸将非细胞面擦一下。

捏住换面，细胞面朝下。

3)将盖玻片轻放在载玻片上，细胞面与封片液接触，用指甲油四周固定；
（第一次涂指甲油，轻轻扫过，悬空不要触碰玻片。

放好第二张片子后，再涂一遍指甲油将片子边缘覆盖。

）
4)将处理好的玻片置于小白盒中，立即观察结果。

PS：一张载玻片最多可放三张盖玻片
可在玻片下垫一张白纸
5、结果观察
本实验中图片摄取具体操作由实验室管理员协助完成，摄取图片后光盘拷出，用Zeiss LSM Data Server程序对图片进行调整和完善
注意：
1、实验前2-3天预约，样品处理好之后最好在普通的倒置荧光显微镜下看过
确认可以摄图再上激光共聚焦显微镜；
2、实验时，请将样品表面的液体擦干，避免滴到镜头上，污染镜头；
3、如使用次数较多较频繁，可在管理员的帮助下熟练掌握仪器的操作规程后独
立完成，但每次实验之前需征得管理员的同意，且不得随意改变仪器设置，如
出现问题，及时上报（操作可参阅Zeiss LSM 510 META - Guided Tour）四、注意事项
除前面过程中附加的注意事项以外，还需注意：
1、操作玻片的过程中要小心，以免玻片碎裂；
2、处理好的玻片最好立即照相，时间长了细胞容易干掉导致形态发生改变；
3、摄取照片时，紫外照射时间尽量短以免荧光淬灭；
绿光M488
红光M594。