高原地区捕食线虫性真菌生物学特性的研究

高原地区捕食线虫性真菌生物学特性的研究作者：张洪波张春霞孙亚丽多杰才旦康明来源：《湖北畜牧兽医》2013年第11期摘要：对祁连县所采土壤中分离得到的少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）进行了生物学特性研究。

结果表明，所获菌用革兰氏染色、瑞特染色均能很好着色；其分生孢子对高温敏感，对低温耐受性强，对抗生素耐受性强。

研究结果为开发高效稳定的生物杀线虫制剂打下理论基础，为该菌的分子机制研究提供参考。

关键词：高原地区；捕食线虫性真菌；生物学特性；寄生虫中图分类号：Q935.6；S852.73 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）11-0005-03真菌是一类具有真正细胞核的、能产生孢子的微小生物，它们一般都能进行有性和无性繁殖。

捕食线虫性真菌是自然界的宝贵资源，它们广泛地分布在土壤里、动物粪便内、动植物残体上、苔藓及植物根下。

该真菌营腐生生活或寄生生活，在正常土壤中处于低代谢状态，初期营腐生生长，后期由于营养竞争进入捕食阶段，它们把线虫作为主要营养来源或作为腐生生活的补充，在保持动植物寄生性线虫生态平衡中起着一定作用[1]。

对捕食线虫性真菌的研究，最早开始于160多年前，Woronin是第一位发现捕食线虫性真菌捕食器的学者，他首次观察到了厚垣孢子的存在[2]。

著名真菌学家Corda1839年发现了杀线虫性真菌的第一个属——节丛孢属（Arthrobotrys Corda），描述了该属的特征，绘制了多孢节丛孢菌（A.superba）的素图。

1938年，Linford 等首次成功应用捕食线虫性真菌控制了菠萝的植物寄生线虫。

在此基础上，各国学者都进行了卓有成效的研究，如美国[3]、加拿大[4]、英国、意大利[5]、法国、前苏联、丹麦等对捕食线虫性真菌进行了全面迅速的研究。

我国于1993年在内蒙古农业大学首先从事了捕食线虫性真菌的生物学特性研究[6]。

为以后在国内运用捕食线虫性真菌进行生物控制寄生性线虫病奠定了基础。

1998年从内蒙古土壤中分离得到少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）CIMHI株，并发现在20 ℃、pH 6，玉米粉浓度为0.4 g/L的玉米粉琼脂（CMA）培养基中比较适宜生长[7]。

2003年董世娟等[8]从土壤和家畜粪便中获得了一种捕食线虫性真菌，并且鉴定其为梨形指环菌（Dactylaria pyriformis）。

中国农业大学1998年首次报道用寡孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）和葡萄串状节丛孢菌（A.arthrobotryoudes）对羊的奥氏奥斯特线虫（Ostertagia ostertagi）幼虫的体外捕食率可达75.0%～96.4%[9]。

放牧家畜寄生虫病的主要感染来源是吞食了处于感染性阶段的放牧草场上的寄生虫，包括感染性幼虫和感染性虫卵，另外也包含有感染性阶段存在的中间宿主、水源等。

线虫是一类在家畜体内寄生数量最多的虫体，家畜摄食了外界环境中线虫的感染性幼虫，幼虫在家畜体内发育为成虫，成虫排卵于外界环境中，卵在外界发育为感染性幼虫，感染性幼虫被家畜食入而造成感染[10]，引起家畜消化系统的诸多病变。

对于牛羊消化道线虫病目前还是以药物进行治疗和控制，在生产实际中有一定的效果。

但是，长期大量使用化学药物不仅会产生耐药虫株，而且会造成食品卫生安全问题。

采用捕食线虫性真菌对寄生性线虫进行控制不但能减少虫体对机体的损伤，同时还能减少机体营养物质的损耗、防止产生抗药性和药物残留问题，对提供绿色有机动物产品，牧区草场的可持续发展，建设绿色、生态畜牧业均具有深远的意义。

国内对捕食线虫性真菌的研究相对较晚一些，在兽医领域，杨莲茹等[6，7]董世娟等[8]在捕食线虫性真菌对家畜寄生性线虫的生物控制方面做了大量的工作，但对于青海省高原地区捕食线虫性真菌分离鉴定、生物学特性等方面的研究工作均尚未见进行。

鉴于此，笔者对青海省祁连县、共和县和泽库县的土壤样品进行了捕食线虫性真菌的分离与鉴定，并对其生物学特性进行了详细研究，现报告如下。

1 材料1.1 药品及器材显微镜（奥特）；琼脂粉（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号20121308）；青霉素（华北制药股份有限公司，批号s1110609）；盐酸（白银良友化学试剂有限公司，批号050315）；氢氧化钠（天津市化学试剂三厂，批号850629）；氯化钠（北京化工厂，批号821212）；新鲜玉米粉（某超市购买）。

1.2 0.4 g/L玉米粉琼脂培养基（CMA）称取新鲜玉米粉40 g，加蒸馏水1 000 mL，微火煮沸1 h补蒸馏水至1 000 mL，多层纱布过滤。

取滤液5 mL，加蒸馏水495 mL，调pH 6.0～6.2，加琼脂粉20 g，经15磅20 min高压灭菌后倾注于灭菌玻璃培养皿备用。

1.3 0.4 g/L玉米粉单抗培养基（SACMA）配制方法同玉米粉琼脂培养基，经15磅20 min高压灭菌后，冷却至50～60 ℃，每1 mL 玉米粉培养基中加入青霉素200 IU，混匀后再倾注于灭菌的玻璃培养皿中备用。

1.4 土壤样品采用等距采样法（每隔60 m采取一定量的土）分别从祁连县采集10份土样（土质湿润），湟源县采集3份土样（土质较湿润），日月山采集4份土样（土质干燥），农牧学院动物房采集3份土样（依次在树根、圈口、墙根采集，其中墙根土质干燥，其他两份土质较湿润），共和县采集10份土样（土质较干燥），泽库县采集10份土样（土质较湿润），备用。

1.5 分生孢子洗脱液取蒸馏水500 mL，加入4.5 g NaCl配成生理盐水，分装于250 mL瓶中，高压灭菌20 min，备用。

1.6 各种不同pH值溶液用分析纯的盐酸、氢氧化钠配制0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L氢氧化钠溶液，用pH试纸以0.1 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值，配制pH分别为4～10的溶液，装试剂瓶备用。

2 方法2.1 第三期幼虫的培养和收集采用线虫幼虫培养法，取新鲜羊粪捏碎后加入少量蒸馏水混匀，捏成山丘状，放在大平皿中将平皿盖压紧，加蒸馏水至平皿2/3处，放在25～27 ℃通风温箱中培养5～7 d；同时从真胃中挑取胃肠道线虫雌虫，挤出虫卵，置于加有盐粒（每平皿加2～4粒盐，不宜过多）的蒸馏水中于25～27 ℃通风温箱中培养7～10 d（每隔2～4 h搅动一次虫卵）。

2.2 捕食线虫性真菌菌株的纯化和分离鉴定将采集的土样用四分法分出少量，以十字划线法在单抗培养基上布土，将培养基放在25～27 ℃通风温箱中培养5～6 d，至菌丝生长后，将线虫第三期幼虫加入真菌培养皿中，置于搪瓷盘内，保持一定湿度，在（26±1）℃通风温箱中培养，每隔2 h观察一次， 3～5 d后若出现捕虫现象，利用高倍显微镜（10×、40×）观察并拍摄照片。

将有捕虫现象的真菌用接种环在显微镜下勾取，同时接种到SACMA，27 ℃通风培养3～5 d纯化收集分生孢子。

将纯化好的分生孢子用洗脱液洗脱后制成小培养，镜下观察。

具体方法参照文献[11]。

2.3 菌丝及分生孢子的收集取分离菌株接种于2组玉米粉琼脂培养基上，每组3个培养基。

其中一组于（26±1）℃通风培养1周，使菌丝布满培养皿；另一组于（26±1）℃培养2周，使分生孢子大量生成。

用洗脱液洗脱后收集备用。

2.4 捕食线虫性真菌染色特性的研究分别勾取上述培养后的菌丝及分生孢子悬液，涂片干燥后，按标准方法做革兰氏、瑞特氏染色并观察结果。

2.5 捕食线虫性真菌分生孢子对外界理化因素抵抗力的研究2.5.1 分生孢子对高温的抵抗力试验取小试管3只，每支试管中加入分生孢子混悬液0.5 mL置于（40±1）℃通风温箱中加热，分别加热10、30、60 min。

用吸管吸取小试管的分生孢子，分多点喷洒式接种于玉米粉琼脂培养基上，置（26±1）℃温箱中，培养72 h后观察分生孢子生长情况，用同样方法观察分生孢子在50、60 ℃温度分别作用10、30、60 min后的生长情况。

2.5.2 分生孢子对低温的抵抗力试验将分生孢子混悬液装入EP管中，密封后置（-30±1）℃冰柜中冷冻2周，取出融化后分多点喷洒式接种于玉米粉琼脂培养基上，置于（26±1）℃通风温箱中培养，72 h后观察其生长情况。

2.5.3 分生孢子在不同pH溶液中的抵抗力试验取小试管7支，分别加入pH值4～10的溶液0.5 mL。

将分离菌株的分生孢子混悬液离心，沉淀物以微量洗脱液摇匀，将浓缩的分生孢子用毛细吸管向每只小试管中加入3滴，与试管中的溶液混匀，而后取每支试管的分生孢子，分多点喷洒式接种于玉米粉琼脂培养基上，置于（26±1）℃通风温箱中培养72 h后，观察分生孢子的生长情况。

2.5.4 分生孢子对抗生素的抵抗力试验取分离菌株的分生孢子混悬液，分多点喷洒式分别接种于玉米粉琼脂单抗培养基和未加单抗的玉米粉琼脂培养基上，置于（26±1）℃通风温箱中培养72 h后，观察生长情况。

2.6 捕食线虫性真菌分布规律的研究将线虫第三期幼虫分别放入从不同地方采集的40份土样培养的真菌培养皿中，观察并判定其是否具有捕食线虫的能力，根据结果得出捕食线虫性真菌的分布规律。

3 结果与分析3.1 捕食线虫性真菌分离鉴定结果根据镜下观察结果，从菌丝、捕食器官、分生孢子生物学形态，鉴定为少孢节丛孢菌（A. oligospora）。

3.2 少孢节丛孢菌的染色特性少孢节丛孢菌经革兰氏染色，菌丝、孢子均呈红色；瑞氏染色，菌丝、孢子均呈蓝色；两种染色方法均为菌丝壁、孢子壁及隔处色深，胞浆内容物色淡或无色。

3.3 少孢节丛孢菌分生孢子对外界理化因素抵抗力3.3.1 分生孢子对高温的抵抗力孢子在不同温度加热不同的时间，经72 h培养后，其生长情况见表1，由表1可见，分生孢子对高温抵抗力比较敏感，60 ℃加热15 min即被杀死。

3.3.2 分生孢子对低温抵抗力少孢节丛孢菌分生孢子在-30 ℃中冷冻2周及融化后，分别接种于玉米粉培养基上，置于（26±1）℃通风温箱中培养后，能够很好生长（图1）。

3.3.3 分生孢子对不同pH值溶液的抵抗力少孢节丛孢菌菌株分生孢子在不同的pH值溶液中作用后，经72 h培养，生长情况见表2。

由表2可见，分生孢子在pH 5～9均能较好生长。

3.4.3 分生孢子对抗生素抵抗力少孢节丛孢菌分生孢子在玉米粉琼脂单抗培养基上能很好生长。

3.4 捕食线虫性真菌的分布规律将不同地区捕食线虫性真菌的分出率进行统计，见表3。

由表3可见，在土质湿润地区捕食线虫性真菌分离率较高。