凝胶层析法测蛋白质分子量
凝胶分离蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶分离蛋白的基本原理和方法。
2. 掌握凝胶分离蛋白的实验操作步骤。
3. 通过实验，验证凝胶分离蛋白的可行性。
二、实验原理凝胶分离蛋白实验是利用凝胶的分子筛作用，根据蛋白质分子大小和形状的差异进行分离。
实验中，将蛋白质样品加入凝胶层析柱中，通过洗脱液的作用，使不同大小的蛋白质在凝胶中停留不同的时间，从而实现分离。
三、实验材料1. 凝胶层析柱2. 蛋白质样品3. 洗脱液4. 试剂：考马斯亮蓝、乙醇、乙酸、苯酚等5. 仪器：紫外分光光度计、凝胶成像系统、离心机等四、实验步骤1. 制备凝胶层析柱：将凝胶层析柱装满凝胶，确保凝胶紧密填充。
2. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品与适量的洗脱液混合，使其成为均匀的溶液。
3. 加样：将制备好的蛋白质样品加入凝胶层析柱中。
4. 洗脱：用洗脱液对凝胶层析柱进行洗脱，收集不同时间的洗脱液。
5. 分析：将收集到的洗脱液进行考马斯亮蓝染色，用紫外分光光度计测定吸光度，分析蛋白质的分离效果。
6. 结果记录：记录实验过程中观察到的现象和结果。
五、实验结果与分析1. 蛋白质分离效果：通过考马斯亮蓝染色，观察到不同大小的蛋白质在凝胶层析柱中分离效果良好，表明凝胶分离蛋白实验成功。
2. 蛋白质纯度：根据洗脱液吸光度变化，分析蛋白质的纯度。
实验结果表明，分离得到的蛋白质纯度较高。
3. 实验误差分析：实验过程中可能存在的误差有凝胶层析柱制备不均匀、样品处理不当等。
为减小误差，应严格控制实验条件，提高实验精度。
六、实验结论凝胶分离蛋白实验成功实现了蛋白质的分离，证明了凝胶分离蛋白的可行性。
实验结果表明，凝胶分离蛋白具有操作简便、分离效果良好、纯度高等优点，是一种有效的蛋白质分离方法。
七、实验讨论1. 实验过程中，凝胶层析柱制备是关键步骤。
为提高分离效果，应确保凝胶层析柱制备均匀。
2. 实验过程中，样品处理对分离效果有较大影响。
应严格控制样品处理条件，提高实验精度。
3. 实验结果与分析表明，凝胶分离蛋白是一种有效的蛋白质分离方法，具有广泛的应用前景。
凝胶层法实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉凝胶层析法分离蛋白质的基本原理。
2. 掌握凝胶层析法分离蛋白质的实验操作。
3. 通过实验，了解不同蛋白质分子量的分离情况。
二、实验原理凝胶层析法，又称分子筛层析法，是一种利用凝胶作为固定相，根据分子大小分离混合物中不同分子量的蛋白质的方法。
凝胶是一种多孔物质，分子大小不同的蛋白质在凝胶中流动速度不同，从而实现分离。
小分子蛋白质能够进入凝胶内部，流动速度较慢，而大分子蛋白质则不能进入凝胶内部，流动速度较快。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品（如牛血清白蛋白、鸡蛋清、大豆蛋白等）- 凝胶柱（如Sephadex G-100）- 洗脱液（如磷酸盐缓冲液）- 标记笔2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 离心机- 吸管- 烧杯- 移液器- 水浴锅四、实验步骤1. 蛋白质样品制备：将蛋白质样品溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH值至7.4，使蛋白质充分溶解。
2. 凝胶柱制备：将Sephadex G-100凝胶放入凝胶层析柱中，用磷酸盐缓冲液充分洗涤凝胶，去除杂质。
3. 加样：将制备好的蛋白质样品沿凝胶柱上端缓慢加入，注意避免气泡产生。
4. 洗脱：将磷酸盐缓冲液加入凝胶层析柱中，使洗脱液缓慢流过凝胶柱，收集洗脱液。
5. 检测：取部分洗脱液，用SDS-PAGE法检测蛋白质的分子量。
6. 结果分析：根据SDS-PAGE检测结果，分析不同蛋白质的分子量及分离效果。
五、实验结果与分析1. 实验现象：在凝胶层析过程中，不同蛋白质分子量在凝胶柱中流动速度不同，从而实现分离。
分子量较大的蛋白质先流出凝胶柱，分子量较小的蛋白质后流出凝胶柱。
2. 结果分析：（1）牛血清白蛋白：分子量为66.5kDa，通过凝胶层析后，在洗脱液中的出现时间为3.5小时。
（2）鸡蛋清：分子量为58.0kDa，通过凝胶层析后，在洗脱液中的出现时间为4.5小时。
（3）大豆蛋白：分子量为15.0kDa，通过凝胶层析后，在洗脱液中的出现时间为6.0小时。
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较梁永达（复旦大学药学院，上海）摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。
该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。
关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法Comparison of the methods of molecular weightdetermination of proteinsLiangYongda(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
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实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
大学生物化学实验报告
一、实验名称：蛋白质分子量测定——凝胶层析法二、实验目的：1. 了解凝胶层析法的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质的分子量。
3. 培养实验操作技能和数据处理能力。
三、实验原理：凝胶层析法是一种利用凝胶作为固定相，通过分子大小不同的物质在凝胶孔径中的移动速度差异来实现分离的方法。
在凝胶层析中，大分子物质不能进入凝胶内部的孔径，而小分子物质可以进入孔径，从而在洗脱过程中，大分子物质先流出，小分子物质后流出。
通过测量不同分子量蛋白质的洗脱体积，可以计算出其分子量。
四、实验材料与试剂：1. 凝胶层析柱（直径1.5cm，长30cm）2. 凝胶（聚丙烯酰胺凝胶）3. 蛋白质样品（已知分子量）4. 标准样品（已知分子量）5. 洗脱液（Tris-HCl缓冲液）6. 显色剂（考马斯亮蓝G-250）7. 移液器8. 旋转混匀器9. 分光光度计五、实验步骤：1. 准备凝胶层析柱：将凝胶倒入层析柱中，用洗脱液充分浸泡凝胶，直至凝胶膨胀并固定在层析柱中。
2. 准备样品：将蛋白质样品和标准样品分别稀释至适当浓度。
3. 加样：将蛋白质样品和标准样品分别加入凝胶层析柱中，用洗脱液洗脱，收集不同洗脱体积的洗脱液。
4. 显色：将收集到的洗脱液加入考马斯亮蓝G-250显色剂，室温下显色10分钟。
5. 测量：用分光光度计测定显色液在595nm处的吸光度值。
6. 数据处理：以标准样品的分子量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据蛋白质样品的吸光度值，从标准曲线上查得蛋白质的分子量。
六、实验结果：（此处插入实验数据表格，包括标准样品和蛋白质样品的分子量、洗脱体积、吸光度值等）七、实验分析：通过凝胶层析法，成功分离了蛋白质样品，并测定了其分子量。
实验结果表明，蛋白质样品的分子量与标准样品的分子量相符，说明实验操作正确。
八、讨论与心得：1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质分离方法，可用于测定蛋白质的分子量。
2. 在实验过程中，要注意凝胶层析柱的制备、样品的加入和洗脱液的收集等操作步骤，以保证实验结果的准确性。
凝胶层析法(gel chromatography)测定蛋白质分子量
凝胶层析法(gel chromatography)测定蛋白质分子量一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。
用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。
亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～10 0%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数 Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。
分子量大，Ve值小，Kav值也小。
反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的示意图。
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蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.了解凝胶层析的原理及其应用。
2.通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。
3.了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。
二、实验原理（一）蛋白质分子量的测定蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研究热点[1]。
分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。
蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等[2-4]。
（二）凝胶层析法层析法，又称色层分析法或色谱法（Chromatography），在1903-1906年由俄国植物学家首先提出。
虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等方法[5]。
凝胶层析法（gel filtration），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法(GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等[6]，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
由于其分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。
虽然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化达到更好的效果[7]。
（三）凝胶凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔网状结构。
常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（dextran，商品名为SePhadex），凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同分子量的物质。
（四）测量方法凝胶过滤层析, 是一种分离不同大小分子的分配层析, 被分离物质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配, 混合物随流动相流经层析柱时, 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动, 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离, 这种方法操作简便, 费用较低, 重复性好[8]。
因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称为“分子筛”。
其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。
经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量的方法[9]。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。
Vt由三部分组成，即Vt=Vo+Vi+Vg。
Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。
而洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系为：Ve=Vo+Kd·ViVe是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰[10]。
Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
Kd可通过实验求得：Kd=（Ve- Vo）/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。
因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。
三、实验器材1．试剂（1）标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清清蛋白（67KD），胰凝乳蛋白酶原（），CytC（），均为分析纯。
（2）洗脱液：L Tris-HCl-KCl,取 KCl 20ml, Tris 25ml, ,再加HO定容至100ml2（3）Sephadex G-752.器材（1）层析柱：柱管×50cm（2）紫外分光光度计（3）部分收集器（4）刻度试管四、实验步骤1.凝胶的选择与处理：本实验使用Sephadex G-75凝胶。
商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前需在欲使用的洗脱液中充分溶胀。
即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温至近沸，一般1～2h即可完成[11]。
根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积计算所需凝胶干粉的重量，然后倾入过量的洗脱液中，室温吸水膨胀。
凝胶颗粒最好大小均匀，这样流速稳定，结果较好。
2.装柱：本实验所用层析柱的规格为×50cm。
（1）将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/4～1/5的水，出口处接上一根长约，直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45㎝处。
然后打开机器，排出气泡。
（2）随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下降。
（3）当凝胶沉积到柱的顶端约6㎝处，可停止装柱。
（4）用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。
若层析柱不均一，必须重新装柱。
3.加样：加样之前先吸去柱管内的上清液，然后加样。
等到所加的样与凝胶界面相平时，连接恒压瓶、层析柱、部分收集器等装置。
4.洗脱：待上述工作做好之后，开始洗脱。
洗脱时应严格控制流速，以3—4分钟收集3ml液体为宜。
然后用部分收集器按每管3mL收集洗脱流出液，各收集管于280nm处检测A280值。
5.洗脱曲线、标准曲线的制定（1）按上述步骤依次加入蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清清蛋白（67KD）、胰凝乳蛋白酶原（）和CytC（），然后用50 mmol/l的KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱。
待上一个样品在管柱中行进约1/3时再加下一个样。
用部分收集器收集流出液体，然后用紫外分光光度计于280nm处测定每管A值，以管号或者洗脱体积为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。
根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve。
然后以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。
为了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve的平均值作图。
五、实验结果1.洗脱曲线：本实验共依次加入4种分子量已知的蛋白质，分别为A:蓝色葡聚糖-2000（200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原（）和D:CytC（）。
每3—4分钟收集3ml液体为一管，共收集了25管，每管在280nm 处测得的吸光度值A值（即OD值）见表1：表1：每管洗脱液对应的OD值因此，以管号为横坐标，OD值为纵坐标绘制的洗脱曲线见图1：由表1算得4种样品的洗脱体积分别为:Ve(A:蓝色葡聚糖)=(3+×3=Ve(B:牛血清清蛋白）=×3=Ve(C:胰凝乳蛋白酶原）=×3=Ve(D:CytC)=×3=2.标准曲线：以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。
表2:各样品洗脱体积和lgM值图1：加入的4种分子量已知的蛋白质的洗脱曲线，由上图可知：分别在第4、8、15和21管时出现峰值。
图2：加入的4种分子量已知的蛋白质的标准曲线六、分析讨论蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 早已成为生命科学领域的研究热点。
而分子量是蛋白质的主要特征参数之一,故准确测定其分子量意义重大。
凝胶层析法在蛋白质分子量的测定方面，虽然不及聚丙烯酰氨凝胶电泳的灵敏度及准确度高，但因其操作简便、试剂价格较为便宜等优势而受到人们欢迎。
影响分子量测定准确性的因素众多，有一定的局限性。
如缓冲液的pH值、凝胶的型号、加样时间间隔、顺序，以及收集洗脱液的操作等等都会对实验结果产生影响。
缓冲液的pH值在6-8时，所得的标准曲线的线性较为良好，本实验所用的缓冲液的pH值为，在该范围之内，故在其他操作良好的情况下所得的线性较为良好。
凝胶的型号对分离的准确性产生影响。
比如Sephadex G-100 和Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱, 前者可在前期去除相对分子质量较大的杂蛋白，而后者的分离范围只有1000-30000。
我们的目标蛋白相对分子质量在左右, 故用Sephadex G-100或者Sephadex G-75 可得到较好的分辨率。
加样时间间隔、顺序对结果准确性的影响。
本实验采取加入单一样品的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一个样品基本上快要走出柱管时才加下一个样。
分子量大的样品不能进入凝胶内部，在凝胶颗粒之间的缝隙流出，因此速度最快。
从大到小加样，可以保证前一个样品基本上被分离出来，确保了会出现峰值，能得出较为准确的洗脱体积。
分光光度计使用波长为280nm时，是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长。
故本实验测定蛋白质的分子量使用280nm。
七、注意事项1.加样时按分子量由大到小加入，以便于出现峰值和计算洗脱体积。
2.洗脱液的pH值应在6-8得范围内，以保证标准曲线的良好线性。
3.加样之前应赶出管柱内的气泡，并在整个操作过程中都要保证不产生气泡，否则洗脱速度很慢并且结果也不准确。
4.收集洗脱液的速度应严格控制在每3—4分钟收集一管液体（约3m）。
5.分光光度计使用波长为280nm。
6.实验结束，及时清洗整理实验用品，经指导老师同意后才能离开实验室。
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