补体结合试验操作规程
补体结合实验方阵滴定法
补体结合实验方阵滴定法补体结合实验方阵滴定法，也称为微量化学实验法，是一种用于检测血清中补体结合能力的生化实验方法。
血清中的补体结合能力是一种重要的免疫功能指标，它能够反映机体抵御病原菌及其他异物侵入的能力，因此与许多疾病的诊断和治疗密切相关。
补体结合实验方阵滴定法主要通过底物和试剂的相互作用来检测血清中的抗体与病原体之间的结合情况。
具体操作流程如下：首先根据需要，将需要检测的抗原物质或病原菌按照不同的浓度分别涂在乙烯基化的微孔板表面上。
然后将待测的血清样品和一个已知浓度的抗体样品在不同浓度下依次加入到微孔板中，并让其充分反应。
接下来，将试剂加入到每个孔中，以引发化学反应并产生信号，以便测定血清中的抗体与病原体之间的结合能力。
补体结合实验方阵滴定法具有许多优点，包括高灵敏度、高特异性、简便、快速、可自动化等，因此在免疫学、生物学、医学等研究领域中得到了广泛的应用。
此方法还可以被用于鉴定生物制剂和疫苗的成分和效价、血清学检测、微生物学检测、药理学及毒理学研究等方面。
在使用补体结合实验方阵滴定法时，需要注意以下几个方面：首先是选择正确的底物或试剂，其次是保证操作的无菌和无干扰、准确加药和清洗控制，避免误差；第三，注意仪器的校准和维护，确保实验过程中的准确性；最后，对实验结果进行准确的数据分析和评估，以便得出准确、可靠的结论。
综上所述，补体结合实验方阵滴定法是一种非常重要的生化实验方法，在疾病诊断和治疗、生物医学工程、科学研究等众多领域中得到了广泛的应用。
使用该方法需要注意操作规范、选择正确的底物和试剂、对实验结果进行准确评估等方面，以确保实验结果的准确性和可靠性。
通过科学的实验设计和精确的操作技能，我们可以更好地了解免疫功能，为疾病治疗和预防提供更加准确的指导和帮助。
补体结合试验步骤
补体结合试验步骤
补体结合试验是一种常用的免疫学检测方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
以下是一般的补体结合试验步骤：
1. 准备试剂：包括抗原、抗体、补体和缓冲液等。
2. 取一定量的待测样本，加入到含有缓冲液的试管中。
3. 加入适量的抗原或抗体，使其与待测样本中的抗原或抗体结合。
4. 加入适量的补体，启动补体反应。
5. 在适当的时间点(通常是30分钟到1小时)，观察是否出现凝集或沉淀等反应。
6. 根据反应结果判断待测样本中是否存在特定的抗原或抗体。
需要注意的是，补体结合试验的具体步骤可能会因不同的试剂盒和实验目的而有所不同。
因此，在进行实验前，应仔细阅读试剂盒说明书并按照要求进行操作。
补体实验报告
补体实验报告篇一：补体结合试验第二节补体结合试验补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。
早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。
这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物（membrane attack complex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。
而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。
该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。
反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。
如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。
因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图二、试验方法补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。
目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合试验原理:
是根据抗原和抗体反应所形成的复合物吸附并激活 补体的原理所设计的一种血清学反应。
有5种成分参与，分属于3个系统： ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗 体（或抗原） ②补体系统 ③指示系统，即SRBC与相应溶血素。
补体结合试验原理
受检系统
指示系统
1、仅有抗原或抗体
红
细
补
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
胞
抗原/抗体
体
溶血素
溶血反应 阳性
2、抗原抗体反应
抗原 补 体
抗体
红细胞 溶血素
阴性
补体结合试验 阴性
阳性
补体结合试验原理
补体 待检系统
指示系统
补体结合试验原理（结果阳性）
补体消耗
待检系统
指示系统（不溶血）
补体结合试验原理（结果阴性）
补体未消耗
待检系统
指示系统（溶血）
•液体混浊呈浅红色为不溶血，液体透明呈红色为溶血。 •第2、3、4管为对照管应溶血，第5管为SRBC对照不应溶血。 •凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血 者为阳性。
取上述混悬液0.1毫升加pH7.4巴比妥缓冲液 0.5毫升，与标本同置37℃ 30min。
结果判断及意义
将50%溶血标准管与各稀释度试管用肉眼比色， 颜色与标准管相同者即为终点。
血清补体C3操作程序
血清补体C3操作程序1.目的规范血清补体C3(C3)检测试验，确保检测结果准确性和重复性。
2．范围本操作规程适用于生化室工作人员、实习人员、进修人员的操作前培训。
3.术语4．测定原理人血清中的补体C3与试剂中适量的特异性抗体发生反应,形成不溶性的免疫复合物,使反应液产生浊度,在抗体量一定的情况下,在600nm处浊度变化的高低与血清中补体C3的浓度成正比关系5. 标本采集与处理5.1病人准备：采血前不作剧烈运动。
5.2标本类型：无溶血的血清，凝固后尽快分离血清，标本严格避免溶血。
5.3标本稳定性：血清中C3活力在室温保存可稳定3天, 2～8℃可稳定7天，-20℃可稳定30天。
6. 试剂6.1试剂：本科使用伊利康试剂盒，即用式液体试剂。
试剂内主要成分如下：规格: R1 1×60ml R2 1×20ml6．2试剂准备试剂为液体双试剂，开瓶即可使用。
6．3试剂稳定性原装试剂在2～8℃避光保存，稳定期12个月。
试剂开瓶载机2～8℃稳定30天。
7.仪器参数设定AU2700参数设定：伊利康试剂仪器参数具体参加试剂厂家提供的相应仪器的参数说明书.8．校准：具体参见临床生化校准程序8.1 校准条件：8.1.1仪器光路系统经过光路保养或更换光源等重要部件后。
8.1.2仪器经过大保养后。
8.1.3挪动仪器的安装地点。
8.1.4更换试剂批号。
8.1.5室内质控失控。
8．2 AU2700伊利康试剂系统的校准：8.2.1 准备：伊利康配套校准物.8.2.2 保存和稳定性：原校准品在2～8℃保存至有效期。
8.2.3保存位置：2号冰箱。
8.2.4操作步骤：蓝色样本架的1号位置放蒸馏水；黄色样本架的相应位置放定标液→仪器主画面[USER] →[Calibration] →[选择校准项目]→[START]→[YES]。
9．室内质控及失控纠正：见临床生化室内质控程序9．1质控物来源：柏乐液体质控品(批号:45612/45613)。
实验十 补体结合反应
实验十补体结合反应目的要求1．以鼻疽补体结合反应为例，了解补体结合反应术式的基本环节。
2．能独立运用本血清学反应的知识，作血清学检验。
操作步骤一、材料准备（一）溶血素从兽医生物药品厂购买，保存于冰箱中，有效期1年以上，1月之内效价变动不大，1月可以测一次效价。
（二）补体从兽医生物药品厂购买冻干补体，保存于冰箱，效价可半月测一次。
也可以采3～4只成年雄性豚鼠血，分离血清，混合，保存于冰箱或冷处，24小时内应用。
若检查材料多，需大量补体时，不从心脏采血，可由颈动脉放血于培养皿中，待血液凝固后移于冰箱次晨分离血清。
如当日采血可直接离心分离血清。
将混合的新鲜豚鼠血清，加入NaCl 达10％，置于冰箱或冷处，保存期可达数日或1周。
（三）绵羊颈静脉采血，盛于预先加玻珠的玻璃瓶中（或加有5％柠檬酸钠水溶液的玻瓶中），然后，将血分盛于离心管中，以每分钟1500～2000转离心10～15分钟，使红细胞下沉，吸弃上清液，加3～4倍生理盐水混合，再次离心，每分钟1500转15分钟。
这样经第三次洗涤后，吸弃上清，将下沉的红细胞配成2.5％红细胞悬浮液（或临用前配制）。
配制好的红细胞下沉液置5～10℃下保存，24小时内可应用。
若发现溶血时需重新配制。
（四）鼻疽抗原从兽医生物药品厂购买。
（五）标准血清鼻疽阴、阳性血清由兽医生物药品厂购买。
（六）被检血清采取被检动物血清。
分离血清后，用生理盐水稀释10倍，加热灭能，以破坏其中补体和其中可能含有的抗补体物质。
马血清加热至58～59℃，维持30分钟，骡驴血清加热至63～64℃，维持40分钟。
（七）生理盐水蒸馏水中加入0.85％化学纯氯化钠，经灭菌后使用。
二、预备试验（一）溶血素滴定将溶血素在水浴箱中加热至56℃、30分钟灭能。
用生理盐水配成1:100的基础稀释液（0.1ml溶血素加入生理盐水9.9ml），取10个试管，按表10-1作各种稀释度（1:1000～1:5000）。
然后另取13支试管，按表10-2加入各成分。
实验一--补体结合实验
实验一补体结合实验实验原理：补体无特异性，可与任何抗体抗原复合物结合而被激活，但不能与单独的抗体或抗体结合。
补体结合试验是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应体系。
绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。
参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：(1)待测系统，已知抗原（或抗体）、待测抗体（或抗原）；（2）指示系统，SRBC、溶血素。
待检测系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待测系统中的抗原抗体相对应；两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。
反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。
实验方法：1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。
2.按照下表加样。
实验结果：结果分析：试管1、5没有发生溶血现象，为补体结合试验阳性，说明其中的抗体抗原发生了特异性结合，消耗了补体；试管2、3、4发生溶血现象，为补体结合试验阴性，说明抗体抗原不对应，没有消耗补体。
1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。
2.各种试剂的吸管不要混用。
3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。
4.水浴时避免水滴滴进试管。
5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。
实验二人外周血单个核细胞分离实验原理：常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。
它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。
而粒细胞和红细胞比重大，为1.092 kg/L左右。
通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。
实验方法：1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。
第四节 补体结合试验
第十一章血清学试验第四节补体结合试验补体结合试验（complement fixation test）是应用可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等，与相应抗体结合后，其抗原-抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入致敏红细胞（溶血系统或称指示系统），既可根据是否出现溶血反应，判定反应系统中是否存在相应的抗原和抗体。
参与补体结合反应的抗体称为补体结合抗体。
补体结合抗体主要为IgG和IgM，IgE和IgA 通常不能结合补体。
通常是利用已知抗原检测未知抗体。
一、基本原理本试验包括两个系统共五种成分：一为检测系统（溶菌系统），即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；另一为指示系统（溶血系统），包括绵羊红细胞、溶血素和补体。
抗原与血清混合后，如果两者是对应的，则发生特异性结合，成为抗原-抗体复合物，这时如果加入补体，由于补体能与各种抗原-抗体复合物结合（但不能单独和抗原或抗体结合）而被固定，不再游离存在。
如果抗原-抗体不对应或没有抗体存在，则不能形成抗原-抗体复合物，加入补体后，补体不被固定，依然游离存在。
由于许多抗原是非细胞性的，而且抗原、抗体和补体都是用缓冲液稀释的比较透明的液体，补体是否与抗原-抗体复合物结合，肉眼看不到，所以还要加入溶血系统。
如果不发生溶血现象，就说明补体不游离存在，表示溶菌系统中的抗原和抗体是对应的，它们所组成的复合物把补体结合了。
如果发生了溶血现象，则表明补体依然游离存在，也就表示溶菌系统中的抗原和抗体不相对应，或者两者缺一，不能结合补体（图11-7）。
二、补体结合试验的基本过程及应用试验分两步进行。
第一步为反应系统作用阶段，由倍比稀释的待检血清加最适浓度的抗原和补体。
混合后37℃水浴作用30～90min或4℃冰箱过夜。
第二步是溶血系统作用阶段，在上述管中加入致敏红细胞，置37℃水浴作用30～60min，观察是否有溶血现象。
若最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合了，反应结果是阳性；若最终表现是溶血，则说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，反应结果是阴性。
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补体结合试验操作规程
试剂：稀释液（0.85%生理盐水）、补体、溶血素、抗原（由生物制品厂或所提供）、阴阳性血清、2.5%绵羊红细胞悬液、受检血清。
（共七种）
材料准备：
1、稀释液（0.85%生理盐水）的配制：8.5g氯化钠加蒸馏水至1000ml。
2、绵羊红细胞悬液的配制：由健康成年公绵羊颈静脉采血，流入灭菌含
玻璃珠的玻璃瓶内，混摇15—20分钟，脱除纤维，使其失去凝固
性。
将脱纤血移入离心沉淀管中，加2-3倍量的生理盐水混匀，
以每分2000转的速度离心沉淀10分钟，使红血球下沉，吸弃上
清液，再加生理盐水用玻棒搅匀再离心沉淀，反复三次，直至上
清液透明为止，最后吸弃上清液，所剩沉淀即为红细胞。
按每2.5毫升的沉淀红血球加入到97.5毫升生理盐水中的比例制备，便为2.5%绵羊红细胞悬液。
此液配制后在5—100C下，24小时内
可应用。
若发现有溶血时，需重新配制。
经常做补体结合试验，
就迫切需要能将红血球保存。
方法是：将无菌的脱纤维蛋白的绵
羊血与无菌的等量的改良的阿尔塞维尔氏液混合于三角瓶中（用
三角瓶有利于扩大血球与空气的接触面积），置冰箱中冷藏可保存
达两个月。
需用时将血球离心洗涤后即可应用。
改良的阿尔塞维尔氏液配法：葡萄糖24.60克，氯化钠5.04克，柠檬酸
钠（含2分子的结晶水）9.6克，蒸馏水1200毫升，10磅10-15
分钟高压消毒后保存。
抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素、补体、由制标单位提供，按说明书使用。
受检血清的收集和处理：以常规方法采血和分离血清，若发现血清混浊或有血细胞混在时，离心沉淀，每分1000转后将上清液分离出来，
然后用稀释液将血清作1∶10稀释，按下表规定的水浴灭能。
操作方法：1.将1∶10稀释经灭能的受检血清加入2支三分管内，每管
0.5ml。
2.其中一管加工作量抗原0.5ml，另一管加稀释液0.5ml。
3.上述2管均加工作量补体，每管0.5ml，震荡摇匀。
4.置37℃~38℃水浴20分钟，取出放于室温（22℃~25℃）。
5.每管各加2单位的溶血素0.5ml，和2.5%红细胞悬液0.5ml，
充分震荡摇匀。
6.再置37℃~38℃水浴20分钟，之后取出立即进行第一次判定。
7.每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照。
被检血清和对照血清均应灭能，要注意的是各材料（特别是补体），
从预备试验到正式试验，所用的溶血素、血球、补体、抗原、已
知阳性血清及已知阴性血清，都必须是同一批，决不能中途更换
另一批，所用补体如为新鲜的豚鼠血清，则从预备试验到正式试
验必须在24小时内做完，以免补体失效。
主试验各要素添加量和
顺序如下表：
布鲁氏菌病补体结合试验
每做一个被检血清，就要做三管（即表中的1、2、3管），其中1是正式管，结果应是：
判断被检血清的结果，就是看第1管，但是有一先决条件，即2-18各对照管均合理想，如表中各对照管应有结果所表示的才行。
第二管是检查被检血清是否抗补体，这管中没有抗原，所以无论什么血清都不能结合补体，补体应余留下来给溶血系而引起溶血，若这一管不溶血，而溶血系又是没有问题的，说明这个血清有抗补体作用，这个血清不能用，或者将血清再加热或进行其他处理，使该血清的抗补体作用消失后再用。
第三管是检查被检血清是否溶血，其中只有血清、血球、盐水，应不溶血，若溶血而生理盐水又没有问题，说明血清本身就能引起溶血，这个血清不能用。
4-18管是各项对照管，无论做多少个被检血清都得做这样的一套对照管（共计15管），其中4-6管是已知阳性血清的对照，7-9管是已知阴性血清的对照，4、7两管性质与1管相似，5、8两管性质与2管相似，6、9两管性质与3管相似，10管是溶血系健全与否的对照，11管是抗原抗补体与否的对照，12管是抗原溶血与否的对照，13管是补体溶血与否的对照，14管是盐水溶血与否的对照，15管是溶血素本身（在没有补体的情况下）是否能引起溶血，16、17、18管是不同补体量的对照。
第一次进水浴箱前，所有试管均内含1.5毫升，第二次进水浴箱前
每管均内含2.5毫升。
进水浴箱前看一看，量过多或过少的管子，都说明操作时有问题，及时找得出原因的改正，找不出原因的重做。
第二次进水浴箱前，各管红血球一定要完全混合好，混合不好得不出正确结果。
水浴箱温度要正确，取试管架出水浴箱时不能将水滴在箱内的其他试管，水一进试管，试管内的血球就可能溶解，结果便不可靠。
第二次置水浴箱中30分钟后取出，先检查对照管，若对照管结果与表中所述完全相符，可作正式试验的第一管的第一次检查，再置室温12小时（避免日光、灰尘、振荡）作第二次检查，检查时与标准溶血管作比较（标准溶血管配法见后）。
第二次检查时由于未溶解的血球下沉，上液的溶血程度能做较好的判断。
但夏日室温高，经静置12小时后管内可能发生溶血，尤其是底部更明显，这点因素一避免，应置于冷处，或将试管架浸于冷水中。
标准溶血管的制备：应在进行本试验的同时配制，所用试验管的管径大小和管壁厚薄，以及各种成分，都必须与本试验时使用者相同。
2.5%溶血红细胞液的配制：取沉积红细胞2.5毫升加于47.5毫升蒸馏水内，使红细胞完全溶解后，添加1.7%盐水50毫升，制成2.5%溶血红细胞液。
然后再用生理盐水稀释5倍，即成0.5%的溶血红细胞液。
为方便计，也可将当日测定补体及溶血素时，完全溶血的各管溶液收集起来，供作配制标准比色管用。
5%红细胞液悬浮液的配法：取2.5%的红细胞液2.5毫升，加生理
盐水10毫升即成。
按下表配制各浓度的标准比色管，摇匀后放置室温下，供第二天终判时比色用。
标准比色管的配制
标准比色管的配制方法及反应判定标准
标准溶血管的制备：
1.取沉淀血球1.25毫升加于蒸馏水98.75毫升中，使血球完全溶解，再
加入氯化钠0.85克，制成1.25%生理盐水溶血液。
2.取沉淀血球1.25毫升加于0.85%生理盐水98.75毫升中制成1.25%生
理盐水红血球悬浮液。
3.按下表加入各成分，即成不同溶血百分率的标准溶血管，并与正式试
验管同置室温12小时，然后与试验管比较。
标准溶血管的制备表
判定标准：
++++：无溶血，红细胞沉于管底或为悬浮。
+++：25%溶血。
++：50%溶血，上清随不同程度溶血，成不同深浅颜色。
+：75%溶血，透明度亦不同。
—：100%溶血，上清透明，呈深红色。
为防止判定错误，可配制溶血标准管。
40%溶血判为阳性反应，50—90%溶血判为可疑反应，100%溶血判为阴性反应。
牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。
血清稀释度。