第二章 酶的生物合成与发酵生产

第二章酶的生物合成与发酵生产酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。

酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。

酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。

生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。

DNA具有基因的具有基因的所有属性。

基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。

核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。

1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。

即：细胞能否合成某种酶分子。

首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。

DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。

（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。

转录：见课件附图，书P102定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。

模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNARNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。

RNA合成过程和RNA链的延伸图解见课件。

（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)1、翻译：以mRNA为模板合成蛋白质的过程。

即以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。

是将mRNA分子上的碱基排列次序转变为多肽链上氨基酸排列次序的过程。

一个起始密码子：AUG，三个终止密码子：UAA、UAG、UGA。

mRNA在细胞内含量很低，但种类非常多。

不同发育时期有不同的mRNA。

在mRNA分子中，三个碱基编码一种AA，被称为密码子（codon），多数AA有2～4个密码子。

tRNA（transfer RNA）是AA的转运工具，携带活化的AA到核糖体上。

种类很多，每种AA都有其相应的一种或几种tRNA。

其二级结构为三叶草型，三级结构呈倒L型，有反密码环，反密码环顶端均有三个核苷酸组成的反密码，与mRNA相应的密码互补结合。

还有接受AA的一端，称为AA臂（见课件）。

rRNA（ribosome RNA）是蛋白质合成的工厂核糖体是一种核酶，因E.coli的23S rRNA能够催化肽键的形成（90年代初），Cech等人证明rRNA能够自身切除内含子，Altman发现RNAase P能将大肠杆菌的tRNA分子从前体形成剪切为最终的功能形式。

所有生物的核糖体都是由大小不同的两个亚基组成的。

小亚基与mRNA结合，沿5′－3′方向移动；大亚基有A位和P位（见课件）蛋白质生物合成是细胞代谢最复杂也是最核心的过程，其中涉及到200多种生物大分子参与作用。

2、翻译过程即蛋白质的合成过程（大肠杆菌）包括：氨基酸的活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止与释放、氨基酸的活化与转运。

①氨基酸的活化与转运每一种AA均由特异的活化酶体系来激活，这种酶叫氨酰tRNA合成酶。

在氨酰tRNA合成酶作用下，AA与tRNA结合为氨酰tRNA。

反应式见powerpoint。

②在核糖体上合成多肽：包括起始、延伸和终止阶段a、肽链合成的起始阶段，分为三步（课件附图）b、肽链合成的延伸阶段c、肽链合成的终止阶段ld、肽链合成的折叠和加工处理：肽链释放出来后，需加工形成完整的空间结构的酶或蛋白质。

二、酶生物合成的调节酶的生物合成要经过一系列步骤，在转录和翻译过程中，究竟哪些因素对酶的生物合成起调控作用呢？研究表明，转录水平的调控对酶的合成至关重要。

定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。

意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。

（一）基因调控理论：P106Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）操纵子——基因表达的协同单位调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。

调节基因常位于调控区的上游。

启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点：RNA聚合酶的结合位点、cAMP-CAP 的结合位点。

CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP)。

只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

cAMP-CRP复合物的作用示意图(见课件)。

操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。

结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。

(二)酶合成调节的类型：P1051.诱导(induction)：按酶的合成受环境影响的不同分为组成酶：合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶类。

如EMP途径中有关酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

只有在环境中存在诱导剂时，它们才开始形成，一旦没有诱导剂，酶的合成就停止。

2.阻遏(repression)分解代谢物阻遏(catabolite repression)反馈阻遏(feedback repression)两者关系：本质上相同，区别在于酶合成调节体系受控制的程度不同。

在微生物育种中常用诱变手段使诱导酶转化为组成酶，以利于大量积累所需的代谢产物。

（三）酶合成的调节机制1.酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。

酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：α-半乳糖苷酶；β-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。

实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。

A、乳糖操纵子的结构有活性的阻遏蛋白与操纵基因结合，使乳糖结构基因不能表达。

（powerpoint附图）B、乳糖酶的诱导乳糖和有活性的阻遏蛋白结合成无活性的阻遏蛋白，不能与操纵基因结合，乳糖结构基因得以表达。

（见powerpoint附图）2.酶合成的阻遏作用（末端代谢产物阻遏作用）：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成。

酶合成阻遏的现象：实验（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在。

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。

色氨酸操纵子——酶的阻遏（课件附图）：阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达；代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达酶的合成和诱导操纵子模型见课件。

阻遏作用机理与诱导作用的机理相似。

无阻遏物时，调节基因（R）产生的阻抑蛋白与操纵基因（O）的亲和力弱，不与操纵基因结合，已结合在启动基因(P)上的RNA聚合酶能顺利通过操纵基因到达结构基因，转录而合成酶蛋白。

当阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白育辅阻遏物特异结合，使其结构发生变化，使阻遏蛋白与操纵基因的亲和力增强，阻止了RNA聚合酶通过，时结构基因上的遗传信息无法转录，酶合成受阻。

3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。

分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。

待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie 或biphasic growth)。

这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。

此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。

三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型——选育营养缺陷型突变株•解除反馈阻遏——选育结构类似物抗性突变株•解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株2.基因工程育种（1）改变细胞调节基因，使菌种由诱导性变为组成型（2）增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。

（二）条件控制1.添加诱导物包括酶的作用底物、反应产物和底物类似物，其中酶的底物类似物最有效，不能被酶作用或很少作用。

2.降低阻遏物浓度避免使用葡萄糖，采用较难利用的淀粉，避免培养基过于丰富，采用补料分批培养方式，分次流加碳源。

3.添加表面活性剂Ｐ110采用诱导物或降低阻遏物浓度的方法存在成本问题和操作问题（流加易染菌），有时采用添加表面活性剂有时采用添加表面活性剂来促进酶的分泌。

原理：细胞内酶含量提高到一定程度，会被细胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂可使胞内酶未被分解即被释放到胞外，因为表面活性剂有助于改善细胞通透性。

4.添加产酶促进剂酶促进剂对不同细胞、不通酶的作用效果各不相同，需通过试验选用适当的产酶促进剂并确定最适浓度。

如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。