第八章免疫学检测方法
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测机体免疫系统产生的抗体或抗原来诊断疾病的方法。
它基于免疫反应的原理，利用特定的抗体和抗原之间的相互作用来检测人体内的免疫反应物质。
目前，免疫学检验已经成为临床诊断和科研领域中不可或缺的重要手段之一1.免疫层析：免疫层析是一种将待检测物质（抗体或抗原）移动到特定层析纸或凝胶柱上，通过与特异抗体或抗原的结合来检测它们的方法。
这种方法操作简单，成本较低，适用于检测体液中的抗体或抗原。
2.酶联免疫吸附实验（ELISA）：ELISA是一种利用酶的催化作用检测抗体或抗原的方法。
它包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等多种形式。
ELISA具有高灵敏度、高特异性、操作简便和成本低廉等优点，广泛应用于临床诊断和科研领域。
3.放射免疫分析（RIA）：RIA是一种利用放射性标记物来检测抗体或抗原的方法。
它的原理是将放射性同位素标记在待测抗体或抗原上，通过测量标记物的放射活性来确定待测物质的含量。
RIA具有高灵敏度和高特异性的优势，但由于放射性标记物的使用，操作相对复杂且安全性要求较高。
4.免疫荧光：免疫荧光是一种利用荧光标记的抗体或抗原来检测待检测物质的方法。
它通过检测标记物的荧光强度或光谱来确定待测物质的存在。
免疫荧光具有高灵敏度、高特异性、操作简便等优势，广泛应用于病原微生物、肿瘤标志物等的检测。
5.流式细胞术：流式细胞术是一种通过流式细胞仪检测细胞表面或细胞内的免疫分子的方法。
它通过将目标细胞与标记有特定抗体的荧光染料反应，再用流式细胞仪对标记的细胞进行激光照射并收集荧光信号来测定免疫分子的表达水平。
流式细胞术具有高灵敏度、多参数分析等优势，广泛应用于细胞免疫学研究和临床诊断。
6.免疫组化：免疫组化是一种利用特异抗体与待检测抗原结合，再通过染色等方法来检测组织或细胞中特定抗原的方法。
免疫组化具有高特异性、高灵敏度、可定量等优势，广泛应用于病理学研究和临床诊断。
免疫学课件——第八章 凝聚性试验
凝聚性试验
一.凝集试验
细菌,红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合 后,在有电解质存在时,抗原颗粒互相凝聚成肉 眼可见的凝集小块,称为凝集反应. 参与反应的抗原称为凝集原,抗体称为凝集 素. 1.直接凝集试验 颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集 现象的试验称作直接凝集试验.
免疫学原理与技术
波片法:定性试验 试管法:定量试验,可以检测血清中是否含有相 应的抗体及抗体的含量,以其两个加号以上 的血清最大稀释度为该血清的凝集价. 生长凝集试验:正在生长繁殖的菌体,由于抗体 的存在,可以凝集生长成团,借助显微镜可 以观测到.
免疫学原理与技术
二.沉淀试验
可溶性抗原(如细菌的内毒素,外毒素,菌体 裂解液病毒的可溶性抗原,血清,组织浸出液等) 与相应的抗体结合,在适量电解质存在下,形成 肉眼可见的白色沉淀,称为沉淀试验.
参加沉淀试验的抗原称为沉淀原,,抗体称为沉淀素,因为沉 淀试验抗原分子小,单位体积含量多,容易过量,所以经常稀释抗原, 并以抗原稀释度作为沉淀试验的效价.
免疫学原理与技术
乳胶凝集试验 致敏乳胶免疫浊度法试验,诊断卡,玻片法 试验. ▲正向间接血凝试验: 用抗原致敏红细胞,以检测血清中抗体. 出现++以上凝集的血清最大稀释倍数既该 血清的血凝价. ▲反向间接血凝试验: 用抗原致敏红细胞以检测抗原称为反向间 接血凝试验.
免疫学原理与技术
▲正向间接血凝抑制试验: 用抗原致敏的红细胞和已知的抗体来检测 未知抗原. ▲反向间接血凝抑制试验: 用抗原致敏的红细胞和已知的抗体来检测 未知抗体.
免疫学原理与技术
单向单扩散
单向双扩散
免疫学原理与技术
双向单扩散
双向双扩散
免疫学原理与技术
免疫学检验常用的方法有哪些
免疫学检验常用的方法有哪些免疫学是研究身体对致病微生物的防御能力以及防御能力失调的科学。
自从1796年E.詹纳使用疫苗预防天花后，免疫学研究开始全面深入地认识微生物在疾病中的作用，以及抗体和反抗原细胞的形成、动员、作用和相互作用所扮演的角色。
免疫学的范围涵盖了变态反应的治疗、器官移植后的免疫抑制以避免排异反应，以及对自体免疫疾病和免疫缺陷的研究。
免疫学常用检测方法主要包括免疫荧光组织化学法、抗原检测法、抗体检测法、化学发光免疫分析技术和酶联免疫吸附试验法等。
一、免疫荧光组织化学法免疫荧光组织化学法严格遵循免疫荧光组织化学基本原理，从基本定义来讲，免疫荧光组织化学以及免疫荧光细胞化学会以荧光为标记物，属于免疫组织化学技术。
早在1942年，Coons等首次在报道中指出用FITC标记抗体，能检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，这是免疫荧光组织化学技术的基础。
在免疫学检验工作中，免疫组织化学技术是用免疫荧光技术对组织内抗原、细胞或者半抗原物质实施检测，结合抗原抗体反应原理，首先将已知抗原或者抗体标记荧光素制作成荧光标记物，然后，用荧光标记物充当分子探针与组织细胞的相应抗原或者抗体反应，这种复合物的荧光素会在检测过程中发出不同颜色的荧光，用荧光显微镜实施观察，就能够对组织细胞中的抗原或者抗体定性，做好定位与定量研究工作。
在检测过程中，蛋白质、酶、核酸、激素、多肽、多糖、磷脂、受体与病原体均可以作为抗原或者半抗原物质。
二、抗原检测法抗原是进入机体内能附着于淋巴细胞表面引发特定免疫反应的外来物质，几乎所有的异物大分子皆可作为抗原，如细菌、病毒、原虫、食物、毒液以及包括人类在内的各种生物细胞和组织。
抗原上面存在一个或者数个可与淋巴球表面接受体结合的部位，称之为抗原决定部位，当抗原决定部位与淋巴球表面接受体结合后，可以激活淋巴球，使其开始分裂繁殖或者引发一系列免疫反应，如制造抗体和活化杀手细胞等以对抗抗原侵入。
实验诊断学：临床常用免疫学检测
各种免疫复合物性疾病等。
二、补体C3 、C4检测
C3：含量最高，是补体系统经典激活途径与旁路激活途径的 汇合点和关键物质，为急性时相反应蛋白。
C4：参与经典途径，多种生物学功能。 临床意义： （1）增高：急性炎症、传染病早期、组织损伤、移植排斥反应
(一)正常血清免疫球蛋白（五大类） ：有抗体活性
IgG---含量最多、比例最高、唯一通过胎盘的主力抗体。 IgA---分泌型IgA（SIgA）主控黏膜局部免疫，存在于外
分泌液中（如唾液、泪液、母乳等）。 IgM---分子量最大、凝集和溶解力最强。 IgD---含量很低功能不祥。 IgE---含量最低、亲细胞、参与变态反应（如寄生虫感染、
NK细胞活性：减低见于血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺 陷病、艾滋病和某些病毒感染等；升高见于宿主抗移植 物反应。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）:由细胞表面的抗 体Fc受体介导。
四、细胞因子（cytokine,CK）检测
概念：细胞因子是一类由免疫细胞和相关细胞产生的调节细胞功能的 高活性、多功能、低分子的分泌性蛋白质，属于微量免疫调节因子。
参考值：形态学法的转化百分率为（60.1±7.6）%。 临床意义：同前，但Down综合征时明显升高。
（三）T细胞分化抗原（CD）测定
1.T细胞分化抗原主要类别： CD3+ —代表总T细胞、 CD4+ —代表T辅助性 细胞（Th）、 CD8+ —代表T抑制性细胞（Ts）。
2.临床意义： CD3+降低：自身免疫性疾病（AID），如SLE、RA等。 CD4+降低：恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、 AIDS、应用免疫抑制剂者
免疫学检测方法及其原理
原理：利用抗原抗体特异性结合 的原理，通过酶催化底物产生颜 色反应，检测抗原或抗体的存在。
步骤：将抗原或抗体固定在固相 载体上，加入待测样品，再加入 酶标记的抗体或抗原，最后加入
底物，产生颜色反应。
优点：灵敏度高，特异性强，操 作简便，可定量检测。
应用：广泛应用于免疫学检测、 疾病诊断、药物研发等领域。
评估药物的疗效和安全性
03
检测方法：使用免疫细胞进 04
筛选结果：根据检测结果，
行药物筛选，如ELISA、流
选择具有治疗效果的药物进
式细胞术等
行进一步研究
科学研究
01
免疫学检测在科学
研究中的应用
02 免疫学检测在生物
医学研究中的应用
03
免疫学检测在生物
技术研究中的应用
04 免疫学检测在生物
制药研究中的应用
2 免疫学检测原理
抗原抗体特异性结合
抗原：能够引起免疫反应的物质，如病毒、细菌 等
抗体：由B细胞产生的，能够识别并结合抗原的 蛋白质
特异性结合：抗原与抗体之间具有高度特异性， 即一种抗原只能与一种抗体结合
结合原理：抗原与抗体结合后，形成抗原抗体复 合物，从而激活免疫系统，产生免疫反应
信号放大技术
免疫学检测方法及其 原理
演讲人
目录
01. 免疫学检测方法 02. 免疫学检测原理 03. 免疫学检测应用
1 免疫学检测方法
抗原抗体反应
01
抗原：能够引起 免疫反应的物质， 如病毒、细菌等
02
抗体：由免疫系 统产生的，能够 识别和结合抗原 的蛋白质
03
反应原理：抗原 与抗体结合，形 成抗原抗体复合 物，引发免疫反 应
免疫学检测方法
性．因此农药残留的免疫学方法检测要较
医学等领域中致病微生物等完全抗原的免 疫学方法检测复杂得多。
• 农药残留酶联免疫，首先要把农药与载体 蛋白连接起来，形成农药一载体蛋白结合 物免疫原，才可用来免疫动物制备抗体。 因此能否合成稳定、具有良好免疫原性的 农药一载体蛋白结合物是整个农药残留免 疫学检测技术研究的关键。
• 在美国有关官方机构，如环境保护署(EFA)，农业 部食品安全检验司(PSIS—USDA)和AOAC已制定厂 农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建 议准则。
• 随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品 化(生产出试剂盒)，免疫学检测技术会成为食品农 药残留和食品安全质量控制的有效快速的检测手 段。
• 10多年前，一些研究者开始尝试把放射免 疫和免疫酶技术用于食品农药残留检测， 并取得极大成功。
• 其中应用最多的是固相放射免疫饱和分析 技术和酶联免疫吸附检测技术。
• 在这些检测技术中其核心反应都是抗原抗 体反应。所谓抗原是指一切具有抗原性的 物质：
• 抗体(又称免疫球蛋白)，是由抗原刺激机体 而产生的特异性球蛋白。
• 免疫学检测系统中的抗农药抗体对于结构非相关 的靶抗原〔农药〕表现极高的特异性，但某些与 检测农药结构密切相关的农药，或待检农药的代 谢产物可能与抗待捡农药抗体发生不同程度的交 叉反应。如果样品中存在这些物质．该农药的定 量检测就会降为半定量或定性捡测。但从另一个 角度看，这种交又反应又是特别有用的．利用这 种交叉反应．可用抗一种农药的抗体对包括母农
检测的食品范围很广．包括水果、蔬菜、饮料、啤 酒、葡萄酒、鱼、肉、猪油、奶、植物油、蜂蜜、 豆类、谷物及谷物加工产品等。
• 该方法不仅可用来定性筛选，而且也可以用来定 量分析，其检测水平在很多农药可达到纳克(ng)甚 至皮克(pg)水平。
免疫学检测方法与操作规范
免疫学检测方法与操作规范免疫学检测方法一直是生物医学领域中的重要技术之一，广泛应用于免疫学研究、临床诊断和治疗监测等方面。
本文将介绍免疫学检测方法的基本原理、常用实验步骤以及操作规范，旨在为科研人员和实验室从业人员提供参考。
一、免疫学检测方法简介免疫学检测方法是通过检测人体免疫系统特异性抗原与抗体之间的相互作用来实现。
其原理基于人体免疫系统对外界病原体的免疫应答，通过检测抗原-抗体反应可以确定某种特定的抗原或抗体是否存在于样本中。
免疫学检测方法常见的类型包括ELISA（酶联免疫吸附测定法）、免疫印迹、流式细胞术等。
每种方法都有其特定的优势和适用范围，具体选择方法要根据实验目的和样本特点来确定。
二、常用免疫学检测方法及操作步骤1. ELISA方法ELISA是一种定性和定量检测抗原或抗体的常用方法。
其操作步骤包括：（1）涂底板：将包含目标抗原的溶液加入微孔板中，并在相应孔中加入阴性对照和阳性对照，孵育后洗涤；（2）加入特异性抗体：将标记有酶的特异性抗体加入孔中，并进行孵育和洗涤；（3）底物反应：加入酶底物，允许产生显色反应；（4）终止反应：加入终止液停止底物反应；（5）测定吸光度：使用酶标仪测定吸光值，计算样品中目标抗原或抗体的浓度。
2. 免疫印迹方法免疫印迹是一种用于检测特异性抗原和抗体的方法，常用于蛋白质的鉴定和定量。
操作步骤包括：（1）蛋白质分离：将待测蛋白经SDS-PAGE电泳分离；（2）膜转移：将分离后的蛋白转移到膜上，如PVDF或NC膜；（3）阻断：用蛋白阻断剂阻断膜上非特异性结合位点；（4）孵育抗体：使用特异性抗体孵育膜，结合目标蛋白；（5）洗涤：洗去未结合的抗体；（6）显色：加入特定底物进行显色反应；（7）图像分析：使用成像系统记录和分析显色结果。
3. 流式细胞术流式细胞术常用于分析和鉴定细胞表面标记物的表达情况，以及细胞在不同状态下的功能。
操作步骤包括：（1）细胞准备：对待测细胞进行处理，包括细胞培养、致死和洗涤等步骤；（2）标记抗体：使用荧光标记的特异性抗体孵育待测细胞，与目标表面标记物结合；（3）洗涤：洗涤去除未结合的抗体；（4）流式细胞仪分析：将标记后的细胞放入流式细胞仪中进行荧光检测和数据分析。
8 第八章 临床常用免疫学检测_诊断学(十三五_第9版)
诊断学（第9版）
一、免疫球蛋白
（五）M蛋白
M蛋白或称单克隆免疫球蛋白，一种单克隆B细胞增殖产生的具有相同结构和电泳迁移 率的免疫球蛋白分子及其分子片段。 1.参考值 阴性 2.临床意义 检测到M蛋白，提示单克隆免疫球蛋白增值并，见于： ➢ 多发性骨髓瘤 ➢ 巨球蛋白血症 ➢ 重链病 ➢ 轻链病 ➢ 半分子病 ➢ 恶性淋巴瘤 ➢ 良性M蛋白血症
诊断学（第9版）
二、补 体 系 统
（六）补体结合试验（CFT）
补体结合试验（CFT)是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的 试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的 试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关抗 原以及HLA的检测和分析中也有应用。
诊断学（第9版）
二、补 体 系 统
（一）总补体溶血活性（C50）检测
总补体溶血活性（CH50)检测的是补体经典途径的溶血活性，主要反映经典途径补体的 综合水平。补体最主要的活性是溶细胞作用，溶血程度与补体量呈正相关，一般以50%溶血 作为检测终点（CH50)。 1.参考值 50-100kU/L（试管法） 2.临床意义 主要反映补体经典途径（C1-C9)的综合水平 ➢ CH50增高 见于急性炎症、组织损伤和某些恶性肿瘤。 ➢ CH50减低 见于各种免疫复合物性疾病、自身免疫性疾病活动期、感染性心内膜炎、病
毒性肝炎、慢性肝病、肝硬化、重症营养不良和遗传性补体成分缺乏症等。
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（7）用酶标分析仪在405,处测定各孔的吸 光度，计算P／N（样品光吸收值与阴
图 方法筛选结果图。
免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布
细胞免疫化学法检测病毒感染
四、
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。 原理及步骤 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （)
转移（印迹）于硝酸纤维素膜
加抗体检测某种特异性蛋白质
图：淋巴囊肿病毒与抗血清的 结果
免疫电镜技术
免疫电镜技术（ ）是一种将免疫学技术与电子显微镜技术 相结合的血清学方法，能使抗原在分子水平上进行定位。 它实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的基本原理应用于 分子水平上。这一技术的发明使抗原和抗体的定位研究达 到了亚细胞或分子水平。主要有以下几种技术。
1、原理
荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记 物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定 条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态 而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐 射形式释放出所有的光能，发射出波长较照 射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免 疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体 技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化 学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合 物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此 借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又 可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和 补体荧光抗体法。
凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价
1.稀释抗体
管号 磷酸盐缓冲液
1
2
3
4
5
6
7
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1.0
兔抗X菌血清
0.1 0.1(1 0.1(
)
2)
0.1( 3)
0.1( 4)
0.1(5 0.0 )
2.玻片凝集法
A.用1移液枪取6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴磷 酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X菌液。
第八章 免疫学检测方法
免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应 的原理建立的各种检测与分析技术，以 及建立这些技术的各种制备方法。
检测技术种类
一、免疫学检测 免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应
中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或 粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原 抗体结合处为黑褐色的颗粒。
斑点免疫金渗滤法（）的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 、 和等。
斑点免疫金渗滤法原理：
为固相载体通过渗滤抗原与抗体在膜上快 速反应标记的胶体金堆积显色。
胶体金
吸水垫
抗原
抗体
NCM
临床应用： 间接法测抗体：
抗原样品抗体金标抗抗体显色 夹心法测抗原：
多抗样品抗原金标单抗显色。
直接法检测抗原 病毒金标单抗
2µl检测样品直径2点晾干；
100µl封闭液，渗入；
入；
100µl的金标抗体，渗
100µl 的0.01M （含0.0520），渗入；
检测结果：红色斑点的为阳性，无红色
检测结果, 红色斑点的为病毒阳性,无红色斑点的为病毒阴性。 , ,, .
免疫金标层析法的应用与研究进展
免疫金层析法快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶 体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术
医学：乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白T 、
荧光色素
异硫氰酸荧光素（） 四乙基罗丹明（200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（)
1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
间接荧光抗体法（）操作步骤如下： （1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定 10。室温晾干。 （2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第 一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育45。 （3）0.01M 洗三次，每次5。 （4）加第二抗体 ，37℃湿盒中孵育45。 （5）0.01M 洗三次，每次5。 （6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。
兽医：猪瘟抗体 食品：克伦特罗（瘦肉精）、氯霉素 其他：饲料中的磺胺类药物残留物、转基因产品
检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由 金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标 单抗-抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素 膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处 的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成 了金标单抗+抗原+包被单抗的夹心结构，最终是 金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼 可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前 行,当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金 标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗 粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是 ：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不显示红 色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有 效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是 金标单抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。
B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。 C.后取5、4……1号管的溶液逐个重复1、2步骤。 D.取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。
沉淀凝集反应
双向免疫扩散沉淀线示意图
琼扩反应
中和实验
荧光免疫技术
荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫 化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术 的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学 及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的 、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛 应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相 应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原 、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的 研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等 方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏 感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解 决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复 杂。
铁蛋白抗体法 酶标记抗体法 重金属标记抗体法
图 胶体金标记免疫电镜结果[(A) (D) = 200 ; (B) (C) = 100 ]
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。
间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病
间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒
直接
间接
（1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血 细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60。
（2）0.01M 洗三次，每次5。
（3）加 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45。
（4）0.01M 洗三次，每次5。
（5）加底物缓冲液发色10，