水解氨基酸样品前处理
氨基酸前处理方法
谷物籽粒等氨基酸的前处理方法1 适用范围本标准适用于氨基酸分析仪测定谷物籽粒中氨基酸含量的样品前处理。
2 方法原理谷物籽粒中的氨基酸，系按一定顺序结合成不同类型的肽和蛋白质，因而在测定前要用一定浓度的酸使蛋白质中肽键断裂，水解成多种氨基酸后，用氨基酸分析仪测定。
由于色氨酸在酸性溶液中水解时易被破坏，须用碱水解。
3 仪器设备3.1 分析天平：感量0.0001g。
3.2 实验室用粉碎机。
3.3 喷灯。
3.4 真空泵。
3.5 真空规。
3.6 恒温干燥箱。
3.7 水解管：用九五料玻璃制的球形管或圆底试管。
体积15-20ml。
3.8 聚四氟乙烯管:φ10×100mm。
3.9 玻璃试管：φ15×180mm。
3.10 浓缩器（可控温，减压）或真空干燥器。
3.11 容量瓶：25ml。
4 试剂除注明者外均为分析纯。
配制试剂均用去离子水，电导率大于1m,-1。
4.1 6mol/L盐酸：盐酸（GB622—77），优级纯，与水按1.1混合。
4.2 4mol/L氢氧化锂：用水溶解168.8g氢氧化锂（Q/HG12—325—83），稀释至1000ml。
4.3 pH2.2缓冲液：19.6g柠檬酸三钠（HG3—1298—80）用水溶解后，加入16.5ml盐酸（GB622—77，优级纯），5ml25%硫代双乙醇，1g苯酚（HG3—1165—78），最后定容至1000ml。
4.4 pH4.3缓冲液：14 71g柠檬酸三钠（HG 3—1298—80）和2.92g 氯化钠（GB1266—77），10.50g柠檬酸（HG3—1108—81），溶解在500ml水中，再加入5ml25%硫代双乙醇，0.1ml辛酸，最后定容至1000ml。
4.5 冷冻剂：液氮或干冰加丙酮（或加乙醇）。
5 试样制备5.1 取有代表性的样品，用四分法分取25g左右，拣去杂质，带壳籽粒进行脱壳。
5.2 将样品放在60-65 恒温干燥箱中。
干燥8h左右冷却后在粉碎机中碾碎，全部通过孔径为0.25mm的筛子，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
色氨酸的测定-碱水解法
水解氨基酸（色氨酸）样品前处理方法
碱水解法（LiOH法）
1.准确称取固体样品50-200mg（精确至0.1mg），称样量可根据样品
中氨基酸大体含量或测试谱图实际效果增减。
A300全自动氨基酸分析仪常规进样浓度为100nmol/ml，可根据此浓度控制样品前处理中的称样量、定容刻度和稀释比例。
2.将称量后的样品置于聚四氟乙烯衬管中，加入1.50 ml LiOH水解
液（4M）。
3.将聚四氟乙烯衬管放入水解玻管中，置于氮吹仪上吹氮15min后，
用酒精喷灯封管。
4.将密封后的水解管放入恒温干燥箱110℃下水解20h。
5.取出水解管，自然冷却至室温，开管。
6.将水解液转移10ml-25ml容量瓶，加入1.00ml HCl溶液（6M）中
和控制pH，然后用超纯水定容至刻度。
7.用一次性注射器取定容后的样品适量，经0.45或0.22μm针头滤膜
过滤至1.5ml进样瓶，供测试使用。
8.实际测试中可以根据需要，使用样品稀释液（醋酸锂缓冲溶液，
pH≈2.2）按比例稀释样品，调节进样浓度。
游离氨基酸样品前处理方法
游离氨基酸样品的制备:
1.如为固体样品，取样品置于打浆机中打碎或碾碎，备用。
含油高时需去除油脂。
2.秤取适量打碎样品于小烧杯中加入适量超纯水，涡旋混合2min，常温下提取氨基酸10-30min，定容至25或50ml 容量瓶中。
（注：液体样品从步骤3开始，无需步骤1和2）。
3.取定容后的样液4ml于离心试管中，按样品：磺基水杨酸（15%）=4：1加入磺基水杨酸，混合均匀。
4.置冰箱中 2-4 摄氏度冷藏静置60min以上。
5.置离心机中以10.000rpm离心15min。
6.取上层清液再次以10.000rpm离心15min。
7.用样品稀释液按1：1--1：100稀释（根据样品中氨氮含量确定稀释倍数，以稀释后样品瓶中氨氮含量
0.01-0.006%进样合适，如酱油氨氮含量0.8，稀释100倍为0.008进样正好）。
8.经0.22-0.45微米过滤器过滤后装入试剂瓶中上机分析。
样品前处理-酸水解
样品前处理
一、前处理方法
氨基酸总量的测定需要三种方法。
通常我们使用酸水解法测定
天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨
酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸等15种氨基酸，用氧化水解法测定胱氨酸和蛋
氨酸，用碱水解法测定色氨酸。
在酸水解过程中色氨酸被全部
破坏，无法测定，含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）会被部分氧
化，无法侧准。
二、采样
样品须具有代表性，用四分法缩减分取25克左右，粉碎并通过
0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后待测。
由于氨基酸在氧
及碳水化合物存在下易破坏，所以样品粉碎时温度不能过高，
需低于50度。
对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需先脱
脂，然后风干，混匀备用。
酸水解的样品应先测定粗蛋白的含
量。
样品的称量需用万分之以上天平。
三、前处理步骤
1、酸水解
A、称取含蛋白7.5-25mg的样品于20ml安培瓶中（切勿贴壁）
B、加入10ml 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后，冲氮气，再
抽真空充氮气，如此重复三次后，在充氮气情况下封口或拧紧螺丝盖。
C、封口后的安培瓶放入110度恒温干燥箱内水解22-24小时
D、冷却、混匀、开管、过滤，定容于25毫升容量瓶，取适量
滤液置于旋转蒸发仪中，60度以下抽真空，蒸干，加少
许水，反复1-2次
E、加入3-5ml PH2.2稀释液，使浓度达到50-250nmol/ml。
混
匀后过0.45微米滤膜，或10000转离心10分钟，后取上清，待上机用。
氨基酸检测方法
氨基酸检测方法引言氨基酸是构成蛋白质的基本单元，研究氨基酸含量和组成对于生物化学、营养学以及医学研究具有重要意义。
因此，发展准确、快速、经济高效的氨基酸检测方法对于科学研究和工业应用具有重要意义。
本文将对目前常用的氨基酸检测方法进行全面、详细、完整地探讨。
二级标题1：高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是目前最常用的氨基酸检测方法之一。
其主要步骤包括样品前处理、色谱条件选择、氨基酸分析等。
三级标题1.1：样品前处理样品前处理是HPLC分析的重要步骤。
常见的样品前处理方法包括去蛋白、去盐处理等。
三级标题1.2：色谱条件选择色谱柱的选择、流动相的配制以及流动相pH值等条件对HPLC分析结果具有重要影响。
正确选择色谱柱和优化流动相可以提高检测灵敏度和分离度。
三级标题1.3：氨基酸分析氨基酸分析是HPLC的核心步骤。
根据氨基酸的特性和分离要求，选择合适的检测器和检测方法可以实现准确测定氨基酸含量和组成。
二级标题2：毛细管电泳法毛细管电泳法（CE）是一种基于电泳原理的氨基酸检测方法。
相比于HPLC，毛细管电泳法具有分离效率高、分析速度快、耗样量小等优点。
三级标题2.1：毛细管电泳原理毛细管电泳的原理基于物质在电场中的迁移速率与电荷大小、大小形状等相关。
通过调节电场强度和控制毛细管表面特性，可以实现氨基酸的分离和检测。
三级标题2.2：毛细管电泳操作步骤毛细管电泳操作步骤包括毛细管填充、条件优化和毛细管后处理等。
正确操作可以提高毛细管电泳的分离效果和检测灵敏度。
二级标题3：质谱法质谱法是一种基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）或液相色谱-质谱联用（LC-MS）的氨基酸检测方法。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高特异性等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
三级标题3.1：气质联用气质联用是质谱法中常用的检测方法之一，通过气相色谱分离氨基酸，并通过质谱进行定性和定量分析。
三级标题3.2：液质联用液质联用结合液相色谱和质谱技术，对氨基酸进行分离和鉴定。
蛋白质水解步骤及方法
蛋白质水解步骤及方法1. 引言蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们在细胞信号传导、酶催化和结构支持等方面起着重要作用。
然而，有时候蛋白质的结构和功能可能需要被改变，这就需要将蛋白质进行水解。
蛋白质水解是将蛋白质分解成较小的肽段或氨基酸的过程，它可以通过不同的方法实现。
本文将介绍蛋白质水解的步骤及常用方法。
2. 蛋白质水解步骤蛋白质水解通常包括以下几个步骤：2.1 前处理在进行蛋白质水解之前，需要对样品进行适当的前处理。
这包括去除杂质、浓缩样品、调整pH值等操作。
前处理的目的是提高水解效率并减少干扰物对结果的影响。
2.2 水解反应水解反应是将蛋白质分子中的肽键断裂，生成较短的肽段或氨基酸。
常用的水解试剂包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、氨基酸酶等。
水解反应的条件包括温度、pH值和水解时间等因素，需要根据具体的实验目的和样品特性进行优化。
2.3 反应终止水解反应完成后，需要及时终止反应以防止进一步的水解。
常用的方法是加入酸性溶液或加热至高温，以使蛋白质水解酶失活。
2.4 样品处理经过水解反应后，需要对样品进行进一步处理。
这可能包括去除未水解的蛋白质残余物、去除杂质等操作。
样品处理的目的是提高分析准确性和纯度。
2.5 分析检测最后一步是对水解产物进行分析检测。
常用的方法包括质谱分析、色谱分析等。
这些技术可以用来确定水解产物的氨基酸序列、相对含量以及结构特征等信息。
3. 蛋白质水解方法蛋白质水解有多种方法可供选择，下面将介绍几种常用的方法：3.1 酸性水解法酸性水解法是将蛋白质在酸性条件下进行水解。
常用的酸性水解试剂包括盐酸、三氟乙酸等。
这种方法适用于大多数蛋白质，但需要注意选择适当的水解时间和温度，以避免过度水解或部分氨基酸的损失。
3.2 预处理加酶法预处理加酶法是在进行水解之前对样品进行预处理，并添加特定的水解酶。
例如，可以使用胃蛋白酶或胰蛋白酶来切割特定的肽键。
这种方法可以选择性地切割特定的肽链，从而得到目标肽段或氨基酸。
含硫氨基酸样品前处理-过甲酸氧化水解法
含硫氨基酸样品前处理—过甲酸氧化水解法A300氨基酸分析仪原理饲料中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)用过甲酸氧化并经盐酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，然后用A300全自动氨基酸分析仪经离子交换和茚三酮柱后衍生，通过570nm可见光光度检测。
试剂1.过甲酸溶液的配制常规过甲酸溶液: 30%过氧化氢与88%甲酸按体积比1：9混合，于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30min，此试剂需现用现配，不可长期放置。
浓缩料用过甲酸溶液：将常规过甲酸溶液中按3mg/mL加入硝酸银即可。
此溶液适用于氯化钠含量小于3% 的浓缩料。
当样品氯化钠含量大于3%时，氧化剂中硝酸银浓度应≥1.454 *C N*m，其中C N为样品中氯化钠含量（mg/mL），m为样品质量（mg）2.氧化终止剂的配制48%氢溴酸偏重亚硫酸钠溶液：33. 6 g偏重亚硫酸钠加超纯水定容至100mL。
3.酸解剂的配制6.0 mol /L盐酸溶液:将优级纯盐酸与超纯水按1 :1(V /V )混合。
6. 8 mol/L盐酸溶液:将优级纯盐酸1133 mL用超纯水稀释至2000 m l。
7.5 mol/L氢氧化钠溶液:取优级纯氢氧化钠30 g，加水溶解并定容至100 ml。
前处理步骤取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25 g左右，粉碎并过0.45 mm 孔径(40目)筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
氧化和水解:称取含蛋白质7.5~25mg的试样双份(精确至0.0001g，样品量不超过75 mg),置于旋转蒸发器20 mL浓缩瓶或浓缩管中，于冰水浴中冷却30min 后加入已经冷却的过甲酸溶2 mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一起置于0 ℃冰箱中，反应16 h。
3.以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同:若以氢溴酸酸为终止剂于各管中加入氢溴酸0.3 mL，振摇，放回冰浴，静置30 min，然后移到旋转蒸发器或浓缩器上，在60℃、低于3.3KPa (25mm Hg柱)下浓缩至干。
水解氨基酸样品前处理
水解氨基酸样品前处理方法酸水解（HCl 法）1．准确称取固体样品50——200mg（根据氨基酸的大体含量，如鱼粉可以少称，水果等可以大量称样），小心加入水解管中，注意：尽量防止挂壁。
左图是水解管的两种式样，其中式样1是一次性使用，管壁要求至少0.5mm中有发生炸管显现，但出现较少；水解管式样2可以多次使用，其管颈较长。
2．小心加入1：1的分析纯盐酸（约6M）10ml3．酒精喷灯封管后置烘箱中于110℃水解22-24小时。
封管的三种方式：第一：液态氮冷冻后封管（注意：冷等时不能将水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）第二：真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管过过程中将软化的玻璃抽碎）第三：氮吹仪吹氮气15分钟后封管。
推荐：第三种方法，比较简单。
左图为封管后的式样，将封管的样品置烘箱中110度水解22-24小时后，取出冷却开管。
4．样品过滤和定容。
水解后的样品取出冷却至室温，开管后用小漏斗和滤纸过滤到25或50ml 小容量瓶中，水解管用去离子水洗涤三次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到小容量瓶中。
定容至刻度线。
5．吸取定容后的样品1-2ml，置真空脱酸仪上脱酸。
温度60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。
厚，如果太薄，水解过程中有发生炸管可能，但出第一：液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将水解管直接置液氮中，否则容易第二：真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管的过程出冷却、开管。
关于蛋白水解前处理的方法主要是三种：脱酸缓冲装置示意图6．脱酸后的样品，加入1-2ml 样品缓冲液，置震荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过0.45或0.22um 过滤器过滤后，上机分析。
附录：第一种是液氮冷冻后抽真空的方法，这种方法用到的设备有：水解管、液氮灌、真空泵、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶（一般采用厚壁锥形瓶，至少三个）第二种：水解管、真空泵、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶第三种：水解管、氮吹仪、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶。
氨基酸分析原理和色谱条件
氨基酸分析原理和色谱条件氨基酸分析是一种常用的生物化学分析方法，用于确定样品中各种氨基酸的含量和种类。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，对于研究蛋白质的结构和功能具有重要意义。
氨基酸分析的原理是通过分离、定量和鉴定各种氨基酸，从而获得样品中氨基酸的信息。
在样品前处理中，首先需要将蛋白质样品水解为氨基酸。
水解反应可以通过酸、碱或酶的作用来实现。
其中，最常用的水解试剂是6M盐酸和6M氢氧化钠。
将样品加入到水解试剂中，通常在110°C下加热8-24小时，使蛋白质完全水解为氨基酸。
水解反应后，通常使用酸或碱中和水解液，保证pH值在中性附近。
在分析测定中，最常用的方法是色谱法。
色谱法根据氨基酸的化学性质，将其分离并定量。
常用的色谱方法有两种，分别是离子交换色谱和手性色谱。
离子交换色谱是氨基酸分析的传统方法之一，其基本原理是利用氨基酸的带电性质，在离子交换树脂上发生吸附和洗脱。
在离子交换色谱中，通常使用强阳离子交换树脂和弱酸模式进行分析。
样品在酸性条件下通过样品加载装置，然后在逐渐提高pH值的梯度条件下进行洗脱。
各种氨基酸根据其酸碱性质的不同，以不同的速率洗脱出来，从而实现氨基酸的分离和定量。
手性色谱是分析氨基酸的另一种方法，其基本原理是利用氨基酸的手性性质进行分离。
氨基酸是手性分子，大部分氨基酸都有两种手性异构体，即L-型和D-型。
手性色谱使用手性固定相，如手性萃取剂、手性离子对等，可以将L-型和D-型氨基酸分离开来，并进行定量。
色谱条件对氨基酸分析的结果具有重要影响。
在离子交换色谱中，选择合适的离子交换树脂和洗脱缓冲液的pH值，以及合适的梯度条件，都对结果产生影响。
在手性色谱中，选择合适的手性固定相，以及优化洗脱条件和检测方法，也对结果产生重要影响。
总之，氨基酸分析是一种重要的生物化学分析方法，可以对样品中的氨基酸进行分离、定量和鉴定。
通过合适的样品前处理和选择适当的色谱方法和条件，可以获得准确和可靠的氨基酸分析结果。
6种葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸含量测定及比较
6种葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸含量测定及比较卫阳飞;宋海;岳国仁;张宏曦;李彩霞【摘要】以异硫氰酸苯酯为柱前衍生试剂,采用Thermo Ac-claimTM 120 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相A为pH 6.5的乙酸钠缓冲溶液,流动相B为甲醇—乙腈—水(体积比20︰60︰20),在流速1.0 mL/min,梯度洗脱,柱温30℃,检测波长254 nm的条件下,建立了高效液相色谱法测定葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸的含量.结果表明,在试验浓度范围内,17种氨基酸的R2均>0.9990;水解氨基酸的加样回收率为92.0％～104.6％,RSD为0.83％～4.07％;游离氨基酸的加样回收率为95.2％～102.4％,RSD为1.06％～3.98％.同时,6种葡萄籽中水解氨基酸的含量为130.46～163.24 mg/g,游离氨基酸的含量为2.04～5.13 mg/g;用于酿造白葡萄酒的雷司令、赛美容和贵人香3种葡萄籽中游离氨基酸含量较高,用于酿造红葡萄酒的黑皮诺、蛇龙珠和赤霞珠3种葡萄籽中水解氨基酸含量较高.该方法稳定可靠,可用于葡萄籽中水解氨基酸和游离氨基酸的含量测定.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2018(034)009【总页数】6页(P77-82)【关键词】葡萄籽;水解氨基酸;游离氨基酸;高效液相色谱法;柱前衍生;异硫氰酸苯酯【作者】卫阳飞;宋海;岳国仁;张宏曦;李彩霞【作者单位】河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室,甘肃张掖734000;河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室,甘肃张掖 734000;河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室,甘肃张掖 734000;甘州区食品药品监督管理局,甘肃张掖 734000;河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室,甘肃张掖 734000;河西学院农业与生物技术学院,甘肃张掖 734000【正文语种】中文葡萄籽是葡萄酒生产过程中的副产物。
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水解氨基酸样品前处理方法
酸水解（HCl法）
1．准确称取固体样品50——200mg（根据氨基酸的大体含量，如鱼粉可以少称，水果等可以大量称样），小心加入水解管中，注意：尽量防止挂壁。
左图是水解管的两种式
样，其中式样1是一次性
使用，管壁要求至少0.5mm
后，如果太薄，水解过程
中有发生炸管显现，但出
现较少；水解管式样2可
以多次使用，其管颈较长。
2．小心加入1：1的分析纯盐酸（约6M）10ml
3．酒精喷灯封管后置烘箱中于110℃水解22-24小时。
封管的三种方式：
第一：液态氮冷冻后封管（注意：冷等时不能将水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）
第二：真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管过过程中将软化的玻璃抽碎）
第三：氮吹仪吹氮气15分钟后封管。
推荐：第三种方法，比较简单。
左图为封管后的式样，将
封管的样品置烘箱中110
度水解22-24小时后，取
出冷却开管。
4．样品过滤和定容。
水解后的样品取出冷却至室温，开管后用小漏斗和滤纸过滤到25或50ml小容量瓶中，水解管用去离子水洗涤三次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到小容量瓶中。
定容至刻度线。
5．吸取定容后的样品1-2ml，置真空脱酸仪上脱酸。
温度60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。
脱酸缓冲装置示意图
6．脱酸后的样品，加入1-2ml样品缓冲液，置震荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过0.45或0.22um过滤器过滤后，上机分析。
附录：
关于蛋白水解钱处理的方法主要是三种：
第一种是液氮冷冻后抽真空的方法，这种方法用到的设备有：
水解管、液氮灌、真空泵、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶（一般采用厚壁锥形瓶，至少三个）
第二种：水解管、真空泵、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶
第三种：水解管、氮吹仪、酒精喷灯（或手持式煤气灯）、电烘箱、脱酸仪、缓冲瓶。
推荐第三种方法：原因是好多单位有氮吹仪，充氮气比液氮冷等成本低廉，液氮容易挥发，安钵瓶中装的液氮即使不用，段时间也会挥发完毕；充氮气不用抽真空，抽真空的方法因为水解管烧结的过程中容易抽碎，但是充氮气则无此麻烦。