无核荔枝MYB转录因子基因克隆及进化分析

无核荔枝MYB转录因子基因克隆及进化分析摘要为获得在无核荔枝中胚珠退化过程中差异表达全长MYB转录因子基因，并为其功能研究打下基础，根据从已构建的无核荔枝胚珠败育SSH消减文库中得到的差异表达的MYB转录因子EST序列，提取高质量的总RNA，运用SMART RACE技术，获得一个1177bp的MYB基因核苷酸序列。

生物信息学分析表明，该序列含有879 bp的开放阅读框，推测的蛋白质为292个氨基酸，具有2个SANT结构功能域，在系统发育树上与大豆MYB基因亲缘关系最近。

该基因为MYB基因家族中的新成员。

Abstract To obtain the full length of MYB gene and lay the foundation its function research that was differentially expressed in ovule degeneration of seedless litchi. The EST encoding MYB was obtained from young abortive ovule of seedless litchi via SSH（suppression subtractive hybridization），high quality total RNA was extracted and obtained a 1 177 bp full length cDNA sequence by SMAT-RACE method，bioinformatics analysis showed that it included an 879 bp open reading frame，encoded a deduced protein with 292 amino acids，and contained 2 SANT domains，phylogenetic tree showed it got the closest relatives with Glycine max. The results showed that it’s a new member of the MYB family.Key words MYB；seedless litchi；gene cloning；phylogenic treeMYB（myeloblastosis）基因家族是一类广泛存在于植物、动物和真菌中的转录因子家族[1]，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用[2-3]。

近年来，越来越多的MYB基因被发现，仅在拟南芥和水稻中已分别有339、230个[4]。

MYB基因在植物中有各种不同的功能。

主要表现在：一是参与对植物激素的应答。

AtMYB2是拟南芥中第一个被发现受ABA诱导的R2R3MYB基因[5]，AtMYB2蛋白和RdBP1bHLH蛋白的互作可能是ABA应答的另一途径[6]，随HvGAMYB蛋白的表达量增加，花药将会变小，颜色变淡；当其表达量超过对照株4倍时，花药不能正常开裂而导致雄性不育[7]，MYB基因还参与生长素、细胞分裂素和乙烯的应答反应[8]。

二是参与苯丙素代谢途径，表现在MYB蛋白对花色素形成有调节作用，在转基因烟草中影响各器官的颜色[9]，在莴苣中AtMYB60可使红色素合成受限[10]，MdMYB1影响苹果的果皮颜色[11]以及玉米褐色组织的合成[12]。

三是参与抵抗逆境胁迫的应答，如苹果MdMYB10能增强抗渗透能力[13]，拟南芥AtMYB102通过调节镶嵌阻遏蛋白的积累增强耐盐力[14]，甜菜BvMYB对抵抗盐胁迫有较好的作用[15]，TaMYB33能显著提高拟南芥的耐旱能力[16]。

四是参与植物细胞的形态和模式建成，Slabaugh et al的研究表明，MaMYB与内质网膜共同作用影响了根的伸长[15]，拟南芥中AtMyb6对种皮黏液沉积和释放起重要作用[17]，AtMyb26和HvGAMyb参与了花药形态建成[18-19]，AtMYB115和AtMYB118对种子胚的发育有较大影响，AtMYB38、AtMYB30和AtMYB18/LAF1参与了下胚轴的伸长中的调控作用[20-22]。

海南无核荔枝是荔枝中的珍稀品种，无核率高达95%，可食率可达90%，是荔枝中可食率最高的品种[23]，具有极高的市场竞争力。

无核荔枝胚珠在开花后30 d左右即停止发育，最后衰老凋亡，因此形成无核果实[24]。

目前关于荔枝种子退化的原因，在形态学和生理生化方面有部分研究[25]，在基因调控方面的研究较少，张以顺等[26]以普通荔枝为材料克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，禤维言等以无核荔枝幼果为材料得到7个与胚败育相关的cDNA片段[27]，该课题组之前也克隆了无核荔枝生长素反应因子（ARF）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂全长基因[28-29]。

无核荔枝胚败育的分子机制尚处于起步阶段，在荔枝或者无核荔枝的胚及种子退化方面还尚未有关MYB转录因子的相关研究，该研究首次以无核荔枝败育胚珠为材料，得到了一个无核荔枝胚败育相关的MYB全长基因，为进一步研究无核荔枝MYB基因的功能奠定基础。

将该基因全长序列通过NCBI网站进行Blastn序列对比分析，结果表明它与蓖麻MYB基因mRNA（ref|XM_ 002530778.1）相似性达87%，与苜蓿MYB基因mRNA （ref|XM_003607152.1）相似性达86%，与菊花MYB基因mRNA（gb|JF795917.1）相似性达84%。

运用SMART软件分析该基因的结构功能域，结果表明，它含有2个SANT结构功能域（图5）。

用DNAMan软件将无核荔枝MYB基因氨基酸序列与已克隆的蓖麻（Ricinus communis）、杨树（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、彩叶草（Solenostemon scutellarioides）、大豆（Glycine max）、桉树（Eucalyptus gunnii）、拟南芥（Arab-idopsis thaliana）、玉米（Zea mays）和陆地棉（Gossypium hirs-utum）比较，在氨基酸序列相似性上按以上顺序由大到小，系统进化分析结果则表明无核荔枝LcMYB基因与大豆、杨树和蓖麻MYB基因亲缘关系较近，与陆地棉和玉米MYB基因亲缘关系较远（图6）。

3 结论与讨论利用RACE技术获得基因未知序列是获得全长cDNA序列的一个常用方法。

如今克隆基因技术有多种方法，如cDNA文库筛选技术、mRNA差异显示技术、染色体步移和基因组减法技术等。

与之相比，RACE技术具有较为快捷、方便以及高效等优点，因此被越来越多人采用，能简单有效地从低丰度的mRNA中快速扩增cDNA末端。

CLONTECH 公司的SMART RACE技术提供了一种在反转录反应里产生完整cDNA序列的有效方法，因此保证了当使用完整的mRNA进行反转录时，就能有效地产生完整的cDNA序列。

为了提高RACE的成功率，除了引物设计，对RACE反应是否能成功，PCR反应条件和优化也起着非常重要作用，当PCR反应循环次数过多，退火温度较低或者模板量过大均会影响试验结果。

在该试验中PCR反应的起始5个循环提高退火温度，能有效地提高RACE结果的特异性。

生物信息学分析表明，该LcMYB基因含有2个SANT结构域，至今尚缺乏关于SANT结构域的研究，虽然Grüne et al研究表明SANT 结构域与MYB结构域具有及其相似结构[32]，而且Boyer et al认为SANT结构域是从MYB结构域中分离而来[33]，但是仍然有一定的差异，所以笔者猜测该基因区别于MYB家族基因具有较特殊的功能。

该基因是无核荔枝败育胚珠差减文库中差异表达的基因，至于该基因功能的研究将继续构建不同的植物表达载体，转化模式植物[34-35]。

该研究也为进一步研究LcMYB功能奠定了基础。

4 参考文献[1] LIPPOLD F，SANCHEZ D H，MUSIALAK M，et al.AtMyb41 regulates transcriptional and metabolic responses to osmotic stress in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2009，149（4）：1761-1772.[2] MARTIN C，PAZ-ARES J.MYB transcription factors in plants[J].Trends Gene，1997，13（2）：67-73.[3] ROMERO I，FUERTES A，BENITO M J，et al.More than 80R2R32MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana[J].Plant J，1998，14（3）：273-284.[4] FELLER A，MACHEMER K，BRAUN E L，et al.Evolutionary and com-parative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors[J].Plant Journal，2011，66（1）：94-116.[5] SEHWEEHHEIRNER C，BEV AN M. The regulation of transcription factor activity in Plant[J].Trend in Plant Seienee，1998，3（10）：278-83.[6] ABE H，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，URAO T et al.Role of arabidopsis MYC and MYB homologs in drought and abscisic acid-regulated gene expression[J].Plant Cell.1997，9（10）：1859-1868.[7] MURRAY F，KALLA R，JACOBSEN J，et al. A role for HvGAMYB in anther development[J].Plant J，2003，33（3）：481-491[8] KRANZ H D，DENEKAMP M，GRECO R，et al. Towards functional characterissation of the members of the R2R3-Myb gene family from Arabidopsis thaliana[J].Plant Journal，1998，16（2）：263-276.[9] PATTANAIK S，KONG Q，ZAITLIN D，et al. Isolation and functional characterization of a floral tissue-specific R2R3 MYB regulator from tobacco[J].Planta，2010，231（5）：1061-1076.[10] PARK J S，KIM J B，CHO K J，et al.Arabidopsis R2R3-MYB transcrip-tion factor AtMYB60 functions as a transcriptional repressor of anthoc-yanin biosynthesis in lettuce（Lactuca sativa）[J].Plant Cell Reports，2008，27（6）：985-994.[11] ZHU Y M，EV ANS K，PEACE C.Utility testing of an apple skin color MdMYB1 marker in two progenies[J].Molecular Breeding，2011，27（4）：525-532.[12] THOMAS J，GUILLAUMIE S，VERDU C，et al.Cell wall phenyl-prop-anoid-related gene expression in early maize recombinant inbred lines differing in parental alleles at a major lignin QTL position[J].Molecular Breeding，2010（25）：105-124.[13] GAO J J，ZHANG ZHEN，PENG R I H E，et al.Forced expression of Mdmyb10，a myb transcription factor gene from apple，enhances tolerance to osmotic stress in transgenic Arabidopsis[J].Molecular Biology Reports，2011，38（1）：205-211.[14] XUE G P，KOOIKER M，DRENTH J，et al.TaMYB13 is a transcriptional activator of fructosyltransferase genes invo lved in β-2，6-linked fructan synthesis in wheat[J].Plant Journal，2011，68（5）：857-870.[15] SLABAUGH E，HELD M，BRANDIZZI F.Control of root hair developm-ent in Arabidopsis thaliana by an endoplasmic reticulum anchored member of the R2R3-MYB transcription factor family[J].Plant Journal，2011，67（3）：395-405.[16] YUXIANG QIN，MENGGHENG WANG，YANCHEN TIAR，et al.Over-expression of TaMYB33 encoding a novel wheat MYB transcription factor increases salt and drought tolerance in Arabidopsis[J].Molecular Biology Reports，2012，39（6）：7183-7192.[17] LIANG YK，DUBOS C，DODD IC，et al.AtMYB61，an R2R3-MYB tra-nscriptional factor controlling stomatal aperture in Arabidopsis thaliana[J].Current Biology，2005，15（3）：1201-1206.[18] STEINER-LANGE S，UNTE U S，ECKSTEIN L，et al.Disruption of Arabidopsis thaliana MYB26 results in male sterility due to non-dehiscent anthers[J].Plant Journal，2003，34（4）：519-528.[19] MURRAY F，KALLA R，JACOBSEN J，et al.A role for HvGAMYB in anther development[J].Plant J，2003，33（3）：481-491.[20] SINGCHUN WANG，QI WEN NIU，CHONG TENG，et al.Overexpression of PGA37/MYB118 and MYB115 promotes vegetative-toembryonic transition in Arabidopsis[J].Cell Res，2009，19（2）：224-235.[21] FROIDURE S，ROBY D，RIV AS S. Expression of the Arabidopsis tra-nscription factor AtMYB30 is post-transcriptionally regulated[J].Plant Physiol Biochem，2010，48（8）：735-739.[22] Yang S W，Jang I C，Henriques R，et al.FAR-RED ELONGATED HY-POCOTYL1 and FHY1-LIKE associate with the Arabidopsis transcript-ion factors LAF1 and HFR1 to transmit phytochrome A signals for inhi-bition of hypocotyl elongation[J].Plant Cell，2009，21（5）：1341-1359.[23] 陈洁珍，欧良喜，吴洁芳，等.荔枝种质资源的研究及创新利用[J].广东农业科学，2003（4）：24-26.[24] 李明芳，郑学勤.荔枝开花结果调控机制及种质分析研究进展[J].热带农业科学，2004，24（2）：41-47.[25] 梁文裕，陈伟，宋瑞峰，等.龙眼胚胎发育研究进展[J].亚热带植物科学，2004，33（4）：65-68.[26] 张以顺，向旭，傅家瑞，等.荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析[J].园艺学报，2004，31（2）：160-164.[27] 禤维言，郑学勤.无核荔枝果实形成差异表达基因cDNA的克隆[J].广西植物，2006，26（6）：597-601.[28] 刘兴地，刘娜，李明芳，等.无核荔枝半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及序列分析[J].安徽农业科学，2012，40（10）：5782-5785.[29] 刘兴地，莫坤联，郑楷，等.无核荔枝生长素反应因子基因克隆及序列分析[J].中国农学通报，2013，29（7）：111-116.[30] LIU X D，ZHENG X Q. An Effective Method for Extracting Total RNA from Young Embryo of Seedless Litchi[J].Agricultural Science &Techn-ology，2008，9（1）：29-31.0[31] 张庆华，茅矛，陈竺.基因组研究中全长cDNA克隆的策略[J].生物工程进展，2000，20（4）：3-5.[32] GR？NE T，BRZESKI J，EBERHARTER A，et al. Crystal structure and functional analysis of a nucleosome recognition module of the remodeling factor ISWI[J].Mol Cell，2003，12（2）：449-460.[33] BOYER L A，LATEK R R，PETERSON C L.The SANT domain：a uniq-ue histone-tail-binding module？[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5（2）：158-163.[34] 李曼，赵芊，刘方，等.植物MYB蛋白与其靶定DNA结合位点之间的相互作用[J].生物学杂志，2013（4）：58-62.[35] 黄宁，李国印，郭晋隆，等.植物MYB转录因子的同义密码子使用偏好性分析[J].热带作物学报，2013（8）：1513-1518.[36] 刘换新，唐松山.Pokemon基因研究进展[J].医学信息：下旬刊，2011，24（5）：377-378.。