多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

５６４－２００２）［２］于 ２００２ 年 予 以 实 施，其 中 病 原 鉴 定、 血清学试验等均通 过 菌 株 表 型 特 征 予 以 确 定，广 大 兽医工 作 者 参 照 此 标 准 进 行 猪 巴 氏 杆 菌 病 的 诊 断［３－６］。但十余年来，分 子 生 物 学 技 术 发 展 迅 猛，许 多新的分子生物学技术已经在巴氏杆菌病诊断中得 以应用［７－９］，这些新技术比传统诊断技术更加 快 速 便 捷。为 此，笔 者 所 在 课 题 组 于 ２０１４ 年 承 担 了 《猪 巴 氏杆菌病诊 断 技 术 》（ＮＹ／Ｔ ５６４－２００２）行 业 标 准 的 修订工作 ，拟将根据细菌的遗传特征建立 的 多 重
收 稿 日 期 ：２０１４－０９－０５；修 回 日 期 ：２０１４－１１－１３ 作者简介：张媛（１９８０－），女，北京人，助理研究员，兽医硕士，主要从事需氧菌类生物制品 的 检 测 工 作，Ｔｅｌ：０１０－６２１０３６３４，
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｕａｎ＠ｉｖｄｃ．ｇｏｖ．ｃｎ。＊通 信 作 者，研 究 员，主 要 从 事 细 菌 类 生 物 制 品 的 管 理 及 检 测 工 作 ，Ｔｅｌ： ０１０－６２１０３６２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｙｕｗｅｎ＠ｉｖｄｃ．ｇｏｖ．ｃｎ
全 血 改 良 马 丁 琼 脂 平 皿 ，３７ ℃ 培 养 １６ｈ。 １．４．２ 菌种的纯粹 性 检 查 菌 种 在 马 丁 肉 汤 小 管 中 应 混 浊 一 致 生 长，在 改 良 马 丁 琼 脂 小 管 和 含 ４０ ｍＬ／Ｌ 新生牛血清及１ ｍＬ／Ｌ 裂解血细胞全血改 良 马丁琼脂平皿上均应纯粹生长。取马丁肉汤培养液 进 行 涂 片 ，革 兰 染 色 ，镜 检 应 为 革 兰 阴 性 杆 菌 。 １．４．３ 菌 株 的 培 养 特 性 观 察 将 ＣＶＣＣ３９０、 ＣＶＣＣ３９１、ＣＶＣＣ３９２株菌 接 种 在 含 ４０ｍＬ／Ｌ 新 生 牛血清及１ｍＬ／Ｌ 裂解血细胞全血改良马丁琼脂平 皿上，３７℃培养１６ｈ，肉眼及在低倍显微镜下 ４５°折 光观察。 １．４．４ 抗原水相的 制 备 挑 取 多 杀 性 巴 氏 杆 菌 培 养特性典型单菌落，接 种 于 改 良 马 丁 琼 脂 小 管 斜 面 培养基，３７ ℃ 培 养 １６ｈ，从 中 选 取 生 长 纯 粹 的 培 养 物作为种子接种改良马丁琼脂扁 瓶 培 养 基，３７ ℃ 培 养１１ｈ。每个扁瓶 培 养 物 用 １５ｍＬ 含 １０ｍＬ／Ｌ 甲 醛的０．０６７ｍｏｌ／Ｌ 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ｐＨ７．２）洗 下，将 菌块摇散过滤，置２～８ ℃ 灭 活 ４８ｈ，灭 活 期 间 摇 动 数次。 １．４．５ 灭活检验 按 照《中 华 人 民 共 和 国 兽 药 典》 二 〇 一 〇 年 版 三 部 中 含 甲 醛 、苯 酚 、汞 类 等 防 腐 剂 和 抗生素的制品的无菌检验方法进行 。 ［１０］ １．４．６ 菌液浓度的 确 定 通 过 与 中 国 细 菌 浊 度 标 准相比较 确 定 菌 液 浓 度。 中 国 细 菌 浊 度 标 准 等 于 ＷＨＯ 颁发的国际浊 度 参 考 制 品（第 ５ 批）７．０ 个 浊 度单位，与其浊度相同时，每 １ｍＬ 巴 氏 杆 菌 菌 液 含 有７×１０８ ＣＦＵ 细菌。 １．４．７ 乳化 将 菌 液 浓 度 用 含 １ｇ／Ｌ ＳＤＳ 的 ＰＢＳ 调整至５×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ，加 入 等 量 的 弗 氏 佐 剂，用 注 射 器 来 回 吹 打 ，当 混 合 物 发 白 、均 匀 时 即 可 。 准 备 １００ｍＬ 烧杯１ 个，加入 ５０ｍＬ 水，加入 一 滴 上 述 乳 化 液 。 当 乳 化 效 果 良 好 时 ，液 滴 在 水 面 聚 集 不 扩 散 ； 如 果 液 滴 分 散 开 来 ，说 明 乳 化 不 完 全 ，继 续 用 注 射 器 吹 打 ，直 至 乳 化 完 全 。 １．５ 定 群 血 清 的 制 备 家兔背 部 皮 下 注 射 弗 氏 完 全 佐 剂 乳 化 抗 原，Ａ 群、Ｂ 群、Ｄ 群抗原各免疫家 兔 ２ 只，每 只 １ｍＬ。２１ ｄ后进行二 免。 二 免 抗 原 量 加 倍，并 用 弗 氏 不 完 全 佐剂乳化，皮下 注 射。１４ｄ 后 进 行 加 强 免 疫。 加 强 免疫时共免疫 ６ 次，抗 原 浓 度 为 ３×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ， 不加佐剂，耳静脉注射，６次加强免 疫 时 每 只 家 兔 的 注 射 剂 量 分 别 为 ０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０ｍＬ，每 次 间 隔 ５ｄ。 第 ６ 次 加 强 免 疫 后 第 ５ 天 采 血 ，分 离 血 清。向血 清 中 加 入 硫 柳 汞 至 终 质 量 浓 度 为 ０．１ ｇ／Ｌ，分 装 后 ，置 ２～８ ℃ 保 存 备 用 。
中 国 兽 医 科 学 ２０１４，４４（１２）：１２８６－１２９１ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
中 图 分 类 号 ：Ｓ ８５２．６１２ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７３－４６９６（２０１４）１２－１２８６－０６
多重 ＰＣＲ 在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用
关键词：需氧菌；多杀性巴氏杆菌；荚膜定群；抗血清；多重 ＰＣＲ；Ｃａｒｔｅｒ氏间接血细胞凝集试验
Hale Waihona Puke Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏ－ｇｒｏｕｐ
ＺＨＡＮＧ Ｙｕａｎ，ＷＥＩ Ｃａｉ－ｗｅｎ，ＬＩ Ｊｉａｎ，ＬＩ Ｗｅｉ－ｊｉｅ，ＪＩＡＮＧ Ｙｕ－ｗｅｎ
（Ｃｈｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｖｉｓｅ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓ（ＮＹ／ Ｔ ５６４－２００２），ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉ－Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
１ 材 料 与 方 法
１．１ 菌 株 血 清 型 参 考 株：ＣＶＣＣ３９０（Ａ 群）、ＣＶＣＣ３９１（Ｂ 群）、ＣＶＣＣ３９２（Ｄ 群）均 从 英 国 国 家 兽 医 学 院 引 进。 致病性猪源多杀性 巴 氏 杆 菌 临 床 分 离 ５３ 株 由 中 国 兽医微生物菌种保藏管理中心提供。 １．２ 培 养 基 及 试 剂 马 丁 肉 汤 培 养 基 、改 良 马 丁 琼 脂 培 养 基 、硫 乙 醇 酸 盐 培 养 基 、酪 胨 琼 脂 培 养 基 、葡 萄 糖 蛋 白 胨 汤 培 养 基、生理盐水、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）均由中国 兽 医 药 品监察所基础保障室提供。 透明质酸酶购自 Ｓｉｇｍａ 公司。十二烷基 硫 酸 钠 （ＳＤＳ）购 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司。 弗氏完全佐剂、弗氏 不 完 全 佐 剂 均 由 中 国 兽 医 药 品 监察所细菌制品检测室人兽共患病组制备。新生牛 血清购自 Ｇｉｂｃｏ公司。裂解血细胞全血由中国兽医 药品监察所细菌制品检测室需氧菌组制备。革兰染 色液试剂 盒 购 自 青 岛 高 科 园 海 博 生 物 技 术 有 限 公 司。中国细菌浊度标准购自中国药品生物制品检定 所。Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶、１０×ＰＣＲ 缓 冲 液、ｄＮＴＰ、 ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ和琼脂 糖 均 购 自 宝 生 物 工 程 （大连）有限公司。 染 料 Ｇｏｏｄｖｉｅｗ 购 自 北 京 赛 百 盛 基因技术有限 公 司。 菌 落 多 重 ＰＣＲ 阴 性 对 照 品 和 阳性对照品均由中国兽医药品监察所细菌制品检测 室厌氧菌组制备。 １．３ 实 验 动 物 和 仪 器 设 备 ２ｋｇ 的 家 兔 购 自 北 京 维 通 利 华 实 验 动 物 技 术 有限公司。 试 验 中 涉 及 的 主 要 仪 器 和 设 备 包 括 ＧＮＰ－ ９２７０型 隔 水 式 恒 温 培 养 箱、ＤＫＢ－８Ａ 型 电 热 恒 温 水槽、电子天平、ＴＨＺ－Ｃ 型恒温 振荡器、Ｈｅｒａｓａｆｅ ＫＳ生 物 安 全 柜、移 液 枪、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ 仪、北 京 六一 电 泳 槽 以 及 Ｗｅａｌｔｅｃ Ｄｏｌｐｈｉｎ－ｃｈｅｍｉ凝 胶 成 像 系统。 １．４ 抗 原 的 制 备 １．４．１ 菌种的开启 开 启 菌 种，用 １．０ｍＬ 马 丁 肉 汤 溶 解 后 ，分 别 接 种 马 丁 肉 汤 小 管 、改 良 马 丁 琼 脂 小 管、含４０ｍＬ／Ｌ 新生牛血清及 １ｍＬ／Ｌ 裂解血 细 胞
ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ５３ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｓｔｒｉｃｔｌｙ ａｇ－ ｇｌｕｔｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ Ｃａｒｔｅｒ’ｓ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｒｏｕｐｉｎｇ Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａｃａｐｓｕｌａｒ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃａｒｔｅｒ’ｓ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ５３ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕ－ ｓｉｏｎ，ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ Ｃａｒｔｅｒ’ｓ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａｃａｐｓｕｌａｒ ｓｅｒｏ－ｇｒｏｕｐ．
第１２期 张 媛等：多重 ＰＣＲ 在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用