pcr和real-pcr检测技术及方法
PCR与Real-time PCR方法检测海产品创伤弧菌的比较
Ｍ ： １ ２ ０ ０ ＤＮ Ｍａ ｋ ｒ Ｃ： Ｄ ， ０ Ａ ｒ ｅ ；Ｎ 阴
游 为 ： ｃｇｃ ｇｔｃａ ｇｔ ｃ ａ一 ， 游 为 ： ， ５ｌｃ ｇ ａ ｇ ｔ ｇ ｇｃ ３ 下 ｒ ＿ ｇ ５＿ ｃ ｃｃｃｃａｃｔ ｃ ｇ 一 ； ｅ ｌ ｉ Ｃ 引 物 序 ｇ ａ ｃ ｔ ｔｇｇ ｃｃ３ Ｒ ａ ｔ — ｍｅＰ Ｒ
列 上 游 为 ： ｔｃｃ ａｃｔｃ ａａ ｃｇ ａ ｃａｔ ａｃ３ ， ５ ｔ ａ ｔ ａ ｃ ａ ｔ ｇ 一 下
反应 性 。
１１ 材 料 ．
鱼、 、 虾 贝类 等海 产 品 以及 创 伤 弧 菌标
准 阳性 菌株 ， 由北京 市 出入境检 验 检疫局 提 供 。 均 １２ 引 物 引 ｖ ｈ 基 因上 一 段 ５ ９ｂ ｖＡ １ ｐ的 序列 Ｐ Ｒ 引 物序 列 上 Ｃ
Ｃｈｎ ｓ ｏ ｒａ ｏ ｔｒ ａｙＭｅｉｎ ｉｅｅ ｕｎ ｌ ｆ ｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ Ｖｅ ｎ ｉ
中 国兽 医杂 志 ２ １ ０ ０年 （ ４ 第 ６卷 ） ８期 第
７ ３
Ｐ Ｒ 与 Ｒｅ ｌ ｉ Ｃ 方 法 Ｃ ａ— ｍｅＰ Ｒ ｔ 检 测 海 产 品创 伤 弧菌 的 比较
０ ５ｔ 超纯 水 ９ｔ 模 板 １ Ｌ， 行扩 增 。 ． Ｌ， ｔ Ｌ， ｔ 进 １ ６ 灵 敏 度 比较 取 两 份过 夜 培 养 的标 准 菌液 各 ． １ｍＬ， 别 以 １ ～ １ 梯 度稀 释 。一 份 采用 煮 沸 分 Ｏ Ｏ 法 提取 ＤＮＡ， 别 进 行 Ｐ Ｒ 和 Ｒ ａ ｔ Ｃ 检 分 Ｃ ｅｌｉ Ｐ Ｒ — ｍｅ 测， 以确 定检 测 限 。另 一份 做 相 应 的菌 落计 数 以定
Real-Time PCR 简介
平台期
Cycle number
1
2
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初 始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：
引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消
耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争
等
PCR 常见问题及分析
1、扩增失败
UNG酶的好处
有效地防止污染������
UNG酶能切断所有含dU的双链或单链DNA
含U的DNA是PCR产物，其气溶胶造成实验室污染
商用PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的 DNA链。在定量PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将已 有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。
不再随循环次数的增加而呈指数增长
技术服务部
靶序列
靶序列
Cycle 1
5' 3'
1
3' 5'
2
5' 3'
3' 5'
Denaturation: 94 – 96°C
5'
3'
5'
3' 5'
5'
3'
3'
Annealing: 50 – 65°C
5' 3'
1
5' 3'
3
5'
4 2
Elongation: 70 – 75°C
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量
四、脱氧核苷三磷酸（dNTP）
dATP、dCTP、dGTP、dTTP(dUTP)的混合物 ,
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
real time RT-PCR
Molecular Beacons
发夹型杂交探针
Molecular Beacons
原理：荧光谐振能量传递（ 原理：荧光谐振能量传递（FRET） ）
环
环与目标序列完全配对
茎
荧光素
茎由互补配对的序列组成
淬灭剂
Molecular Beacons 优点
对目标序列有很高的特异性 ——SNP检测最灵敏试剂之一 SNP检测最灵敏试剂之一 SNP 荧光背景低
朱红 空白 87.3
HC 、HSC 2d 1 HSC 4d 、 HSC 2d 2 88.3
63度20s 度
HSC 2d 1 、 HSC 4d 88.3
65度20s 度
标准曲线制备
体外转录RNA 体外转录 体外合成ssDNA 体外合成 纯化的质粒dsDNA 纯化的质粒 cDNA PCR产物 产物 将待测基因的PCR产物用胶回收试剂盒进 将待测基因的 产物用胶回收试剂盒进 行纯化，然后按10倍梯度稀释即可得到标 行纯化，然后按 倍梯度稀释即可得到标 准品，用于做标准曲线。 准品，用于做标准曲线。
Molecular Beacons 缺点
设计困难
只能用于一个特定的目标 价格较高
TaqMan
TaqMan
荧光素 淬灭剂
探针
水解型杂交探针
TaqMan
目标特异性探针 5’ 为荧光素， 3’ 为淬灭剂
5’ 荧光素 3’淬灭剂
与目标序列互补
TaqMan
R F Q R
工作原理
报告基团被淬灭
R 报告基团 Q 淬灭基团
Ct值的概念 Ct值的概念
Ct值的定义是 值的定义是PCR扩增过程中 ， 扩增产物 扩增过程中， 值的定义是 扩增过程中 (荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期） 荧光信号） 荧光信号 到达阈值时（进入指数增长期） 所经过的扩增循环次数 所经过的扩增循环次数
pcr技术及其产物鉴定实验步骤
pcr技术及其产物鉴定实验步骤介绍PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可在实验室中复制并扩增特定的DNA片段。
该技术在基因测序、疾病诊断和遗传学研究等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍PCR技术的基本原理以及实验步骤，以及PCR产物的鉴定方法。
PCR技术原理PCR技术基于酶的活性，通过体外复制DNA。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被加热分解为两条单链。
在退火步骤中，引物（即DNA复制所需的起始序列）与目标DNA序列的互补部分结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶在退火后重新合成DNA链。
PCR实验步骤以下是PCR实验的一般步骤：1. 样品准备从待检测的样品中提取DNA。
可以使用多种提取方法，如正常提取、血液提取或组织提取方法。
2. PCR试剂准备准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液和PCR酶。
3. PCR反应设置将PCR反应液分装到聚合酶链式反应管中。
4. PCR反应条件设置PCR反应条件，包括温度和时间。
5. PCR循环将PCR反应管放置在热循环仪中进行PCR循环。
PCR循环的次数取决于所需扩增的DNA片段的数量。
6. 电泳分析使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，然后通过电场使DNA在凝胶中移动，并使用紫外线照射来观察DNA片段的迁移。
PCR产物鉴定方法通过PCR产物鉴定可以确定目标DNA片段是否被扩增成功。
以下是PCR产物鉴定的几种常用方法：1. 凝胶电泳分析将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，并通过电泳分析来观察DNA片段的迁移和大小。
2. DNA测序通过DNA测序技术来确定PCR产物的序列，从而验证目标DNA片段的扩增情况。
3. 启动子鉴定通过PCR产物的韧带背法或限制酶切等实验方法，来鉴定目标DNA片段是否存在期望的启动子序列。
结论PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，可以高效地扩增特定的DNA片段。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时pcr技术的原理
实时PCR技术的原理实时PCR（Real-time PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术。
它在PCR反应的过程中，通过测量PCR产物的数量的变化来实时监测DNA或RNA的扩增情况。
实时PCR技术具有高度敏感性、快速性、精准性和广泛的应用范围，成为了分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的重要工具。
一、PCR（聚合酶链反应）的基本原理PCR是一种体外扩增DNA序列的技术，通过反复的循环扩增，能够从少量DNA样本中产生大量DNA。
PCR反应由三个步骤组成：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
其中，变性步骤是将DNA双链解开，使其成为单链；退火步骤是将DNA引物与目标序列的互补区域结合；延伸步骤是利用DNA聚合酶酶活性进行新链的合成。
这些步骤的循环扩增使得DNA的复制指数级增加。
二、实时PCR的优势相较于传统PCR技术，实时PCR具有以下几个优势：1.实时监测：实时PCR可以在PCR过程中实时监测PCR产物的变化，通过检测荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。
这种实时监测的方式省去了传统PCR后续检测步骤的时间，提高了实验效率。
2.高度灵敏：实时PCR技术可以检测非常低浓度的DNA或RNA，甚至能够检测单个拷贝的目标序列。
这使得实时PCR在分子诊断和病原体检测中具有非常重要的应用价值。
3.高度精准：实时PCR具有较低的误差率，可以精确定量目标序列的拷贝数。
这对于研究基因表达调控、检测基因突变等方面非常重要。
4.高通量性：实时PCR技术可以通过多重荧光探针或染料的设计，同时检测多个靶标序列。
这样可以大大提高实验的通量和效率。
三、实时PCR的基本原理实时PCR可以使用不同的荧光信号来实现PCR产物的实时监测，其中最常用的有SYBR Green和探针法。
1.SYBR Green法：SYBR Green是一种荧光染料，与DNA结合后发出荧光信号。
在实时PCR过程中，SYBR Green会结合到PCR产物上，发出荧光信号，从而实现PCR产物的检测。
real-time rt-pcr的原理
real-time rt-pcr的原理
实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）的原理基于实时荧光定量PCR技术，结合了逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个技术。
首先，通过逆转录将RNA转录成cDNA。
这个过程由逆转录酶和引物完成，
引物与目标RNA序列的特异性序列互补。
当引物与目标RNA序列结合时，逆转录酶开始参与反应，通过循环变化的温度条件，使RNA序列转录成互补的DNA（cDNA）。
然后，这个cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系中含有荧光探针和
引物，引物与cDNA的特异性序列互补。
当引物与cDNA序列结合时，通过循环变化的温度条件，使DNA片段扩增。
在PCR扩增过程中，荧光信号发生器被激活，荧光信号开始释放。
荧光信号的释放与DNA片段的扩增相关联，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA片段的扩增情况。
通过比较荧光信号的强度与标准曲线，可以确定初始样品中目标RNA的量。
总之，实时反转录聚合酶链式反应是一种高灵敏度、高特异性的RNA检测技术，广泛应用于基因表达分析、病毒检测和基因突变研究等领域。
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核酸提取试 剂盒
国家/项目 标准
文献报道
PCR kit
设计合成
Taq酶 dNTP 缓冲液 Mg离子
特异性引物
国家/项目标准 文献报道
设计合成
引物设计
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。
➢ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） ➢ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
琼脂糖电泳原理
琼脂糖凝胶电泳步骤
配胶
点样
电泳
胶图分析
成像拍照
配胶
✓ 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末 ，放入锥形瓶，加入适量0.5×TBE电泳缓冲液
✓ 置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后 ，加入核酸染料（例EB或其他替代产品），混匀后，倒 入胶托模具内
✓ 待胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽内的缓冲液没过胶 面
引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；
引物二聚体
发夹结构
Primer Premier 5.0
PCR体系配置
引物合成稀释
➢ 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min
成分
➢ 小心开盖，防止粉末喷出
➢ 储存液配置：用Rnase Free Water溶解， 加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时 为100pmol/μl，即100μM（例如：合成 9.5nmol，则加水量为10×9.5=95μL）
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，
否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；
数量关系
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
TaqMan法优缺点
优点
• 对目标序列的高度特异 性
• 阴性结果确定 • 引物设计相对简单 • 重复性比较好
缺点
• 只适合一个特定的目标 • 委托公司标记，价格较
高
Real-Time PCR使用的染料
度得以测量。
基线
阀值
Ct值 [DNA]0
什么是Ct值？
✓ 扩增产物荧光信号达到设定阀值时经过的扩增循 环次数，或从基线到指数增长的拐点所对应的循 环次数
基线 阀值 Ct值
为什么Ct值∝ [DNA]0？
理想PCR反应：N=N0×
[DNA]0
为什么Ct值∝ [DNA]0？
标准曲线：Ct值对[DNA]0作图
拖尾
✓ 模板不纯或降解 ✓ Buffer不合适 ✓ 退火温度偏低 ✓ 酶量过多 ✓ dNTP、Mg2+浓度偏高 ✓ 循环次数过多
PCR常见问题
假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策
✓ 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外；
✓ 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。
10×buffer dNTP （10mM each） MgCl2 （2.5mM）
➢ 使用浓度配置：普通PCR引物溶度为20μM， Primer-F（20μM）
将100μM的储存液5倍稀释即可
Primei-R（20μM）
20 μ l体系 ➢ 根据说明书依次配置，如右图 ➢ PCR反应组分在在冰上配置 ➢ 设置阳参和阴参
点样
根据样品的不同有两种点样体系： ✓ 样品+6×loading buffer ✓ 样品直接点样（如SSP） ✓ 最后记得点marker，并摆正胶的位置
电泳
✓ 点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始电泳，当 溴芬兰的条带（蓝色）移动到一定长度后即可停止电泳
✓ 一般恒电压60-100V，电泳20-40min即可
基线
阀值
Ct值 [DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分,基线（空白）信号的产生是由于测 量的偶然误差引起的。
基线 阀值 Ct值 [DNA]0
什么是阀值？ ✓ 阀值=基线（背景）信号标准偏差×10. ✓ 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阀值的概率
小于10-5 ✓ 当信号大于阀值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强
Dye Fluorescein FAM SYBR Green I JOE VIC Cy3 TAMRA ROX Texas Red Cy5
Excitation maximum (nm) 490 494 494 520 538 552 560 587 596 643
Emission maximum (nm) 513 518 521 548 552 570 582 607 615 667
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小 沟区域具有绿色激发波长的染料。
TaqMan探针为一段寡核苷酸 5’端标记一个报告基团（Reporter） 3’端标记一个淬灭基团（Quencher）
SYBR Green数量关系
每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料 结合上去
染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比
成像拍照及胶图分析
PCR常见问题
无扩增产物
✓ 模板:含有抑制物，含量低 ✓ Buffer对样品不合适 ✓ 引物设计不当或者发生降解 ✓ 退火温度太高
PCR常见问题
非特异性扩增
✓ 引物特异性差 ✓ 模板或引物浓度过高 ✓ Mg2+浓度过高 ✓ 酶量过多 ✓ 退火温度偏低 ✓ 循环次数过多
PCR常见问题
SYBR Green I 作用机理
SYBR Green I染料法-融解曲线
✓ 溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。 ✓ 扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解
曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号 降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图 ✓ 扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这 个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不 同的温度溶解.
RT-PCR
• 操作简便 • 有效降低污染 • 特异性RT Primer • 特异性和灵敏高 • 大量样品分析 • 定性
Real Time PCR引物设计
Real Time PCR引物设计原则
Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR的用途
绝对定量的定义
绝对定量分析要素
RV-F2 RV-R2
ACCRASTACTTTGGGTRWCCGTG CTGTGTTGAWACYTGAGCICCCA
5’NCR-VP4/VP2 110bp
巢式PCR-鼻病毒检测
第一轮(RT)-PCR
1.在配液室配制反应体系
体系组成 扩增的酶和buffer等 RV-F1 50umol/L RV-R1 50umol/L RNase Free Water
，并在另一封闭空间加样
巢式PCR的引物设计
✓ 外侧引物比内侧引物Tm值低4℃以上 ✓ 外侧引物比内侧引物相距大于6bp以上
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对 起始模板进行定量分析的方法
与普通PCR的区别
普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
PCR实验原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片 段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半 保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成 新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的 DNA片段得到扩增。
正义链
反义链
模板DNA变性
PCR反应原理
1X
35X
1X
94ºC 5 min
SYBR Green I染料法-融解曲线
SYBR Green法优缺点
优点
• 对DNA模板没有选择性 • 使用方便 • 不必设计复杂探针 • 非常灵敏 • 便宜
缺点
• 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性。
• 对引物特异性要求较高 • 灵敏度相对较低
TaqMan探针的FRET
TaqMan作用机理
✓ 各种试剂先进行分装，低温贮存。 ✓ 设置阳性和阴性对照，重复实验
巢式PCR
✓ 巢式PCR：嵌套式PCR，nest-PCR ✓ 巢式PCR是一种变异的PCR，使用2对（非1对）PCR引物
扩增完整的目的基因片段 巢式PCR的应用： ✓ 病毒检测：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 ✓ 测序反应：Illumina公司平台的第二代高通量测序中，也
One Step和Two Step RT-PCR的选择
One Step和Two Step RT-PCR的选择
Two-Step
RT-PCR
• 高扩增效率 • cDNA使用更加灵活 • 更多RT Primer选择 • PCR扩增失败时便于分析
原因 • 检测多种目的基因 • 半定量RT-PCR
One-Step成功的荧光定量CR数据理想的荧光物质的特点
✓ 本底低 ✓ 荧光强度高 ✓ 每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这
种荧光强度的增高和每轮循环后的PCR产物的量成 线性关系 ✓ 没有PCR产物，没有荧光 ✓ 该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄， 各种荧光不会产生荧光的交叉干扰
荧光定量PCR化学原理
应用类似巢式PCR的原理，进行目的片段的扩增。 ✓ 低表达基因检测