生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析共27页
生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理步骤试剂配制结果分析分析
生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理步骤试剂配制结果分析分析DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物化学分离和分析方法，可以根据DNA片段的大小进行分离和鉴定。
它通过将DNA样品加载在琼脂糖凝胶孔隙中，利用电场的作用使DNA片段沿电场方向迁移，从而实现分离和鉴定。
以下是关于DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制和结果分析的详细解释。
原理：DNA琼脂糖凝胶电泳原理是根据DNA片段的大小和电荷来进行分离。
琼脂糖凝胶是一种大分子网状结构，DNA片段在凝胶中迁移时受到阻碍，较短的DNA片段能够比较快速地通过凝胶，而较长的DNA片段迁移速度较慢。
步骤：1.准备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉溶解在缓冲液中，加热，混合均匀后倒入电泳槽。
插入槽糖待凝固。
2.准备DNA样品：将待测的DNA样品加入到琼脂糖样品缓冲液中。
可加入染料以便可视化DNA迁移。
3.加载DNA样品：将DNA样品缓冲液均匀地加载到琼脂糖凝胶孔隙中。
4.进行电泳：将电泳槽两端连接上电源，设定合适的电场强度和电泳时间，使DNA片段在凝胶中迁移。
5.可视化DNA片段：停止电泳后，将琼脂糖凝胶转移到紫外可视化仪中，或者使用DNA染料染色，然后观察和记录DNA片段的迁移位置。
试剂配制：1. 缓冲液（TAE缓冲液）：配制1X TAE缓冲液的方法是将0.4 MTris（pH 8.0）、0.2 M醋酸和0.01 M EDTA混合，在加75 ml水至1 L，将该缓冲液与琼脂糖按比例混合。
2. DNA染料：可以使用SYBR Green I等DNA染料，按照厂家说明进行稀释。
结果分析：DNA琼脂糖凝胶电泳的结果主要通过观察和记录DNA片段的迁移位置来进行分析。
根据DNA片段的大小，可以判断不同样品中的DNA片段是否存在，或者根据已知大小的DNA片段作为标记物，来确定未知DNA片段的大小。
通常，较小的DNA片段迁移得更快，迁移距离较大，而较大的DNA片段迁移得更慢，迁移距离较短。
生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶 中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 b 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝
琼脂糖凝胶电泳及DNA纯化
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛 DNA 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 DNA分子的大小使其分离 因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程 可以通过把分子量标准参照物 分子量标准参照物和样品一起进行电 可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电 泳而得到检测。 泳而得到检测。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子， 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物 可与DNA分子形成EB 复合物， 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。 DNA的含量成正比 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。 计样品DNA浓度。 DNA浓度
配制多大浓度的琼脂糖凝胶， 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。 分子大小来确定。 分子大小来确定
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 分辨范围 琼脂糖凝胶浓度与线性
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用 ℃ 保存备用.
常用的6X载样缓冲液 常用的6X载样缓冲液 6X载样 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖 水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油 水溶液
均匀混合后60℃加热融化胶块。间断振荡混合，使胶块 充分融化(约10分钟)。 5. 将融化的胶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱 中(吸附柱)，室温放置2分钟，12000rpm室温离心1min。 （如果溶胶液大于750微升，则可多次上样） 6. 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱 放入同一个收集管中，加入500微升 Wash solution， 12000rpm 12000rpm室温离心1分钟 1 7. 重复步骤6一次 8. 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱 放入同一个收集管中，12000rpm室温离心2分钟。 9. 将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中 央加入40µL Elution Buffer放置2分钟。 10. 12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的 DNA片段，可以立即使用或保存于-20度使用。 4.
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
琼脂糖凝胶电泳检测DNA1. 实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
2. 实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。
溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。
在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。
与DNA结合的染料在紫外线下呈现橙色荧光。
3. 实验设备移液器，tip头，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶4. 实验试剂琼脂糖，1×TAE（Tris-乙酸0.04M，EDTA 0.001M，pH值为8.2），1mg/ml溴乙锭，上样缓冲液。
EB一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为0.5µg/ml，EB见光易分解，故应在棕色试剂瓶中于4℃条件下保存。
电泳缓冲液（50×TAE）：242 gTris，57.1 ml冰醋酸，100ml 0.5 M EDTA（pH=8.0）。
上样缓冲液的功能：增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。
溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。
5. 实验步骤（1）用透明胶带将胶板的两端封好。
（2）称取0.16 g琼脂糖于50 mL三角瓶中，加入1×TAE 缓冲液20 mL，配配制0.8 %的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
（3）待琼脂糖溶液冷却至60 ℃左右时，加入2 µL溴化乙锭（EB）充分混匀。
（4）在距底板0.5~1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶槽中，凝胶厚度在3-5 mm之间。
（5）凝胶完全凝固后（室温下30~40 min ），去掉透明胶，小心将胶板移至装有1Х TAE buffer的电泳槽中，轻轻拔去梳子，往电泳槽中注入1Х TAE 电泳缓冲液，没过胶面约1 mm 。
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法[实验原理]电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。
包含电解质的多孔支持介质----“胶”并把它置于静电场中。
则DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。
当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。
因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。
该过程通过把示踪染料（Purple Loading Dye）或分子量标准参照物(Ladder)和样品(DNA&RNA)一起进行电泳而得到检测。
分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。
[实验用品]1.琼脂糖 1.0%1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液(TAE),微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时可加入10mg/ml溴化乙锭10μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子(鉴定胶用细密点的梳子；回收胶用粗稀的梳子）的胶膜中在室温下放置30-45min后现进行电泳。
1.5%:琼脂糖1.5g。
2.电泳缓冲液50×TAE Tris 乙酸 Tris 242g 终2 mol/L乙酸57.1ml 终1mol/L0.5M EDTA200ml pH8.0 终100mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释1×TAE。
5×TBE Tris 硼酸 Tris 54g 终445mmol/L硼酸27.5g 终445mmol/L0.5M EDTA20ml pH8.0 终10mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释10倍成0.5倍如50ml贮存液+450ml水→500ml工作液。
[实验内容与方法]1.移取适量的琼脂糖(如制备1%的琼脂糖胶液就移1g的琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹 转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器的使用方法可参 照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质 时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有 多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆
CM
β
前β α
正常
Ⅰ型
Ⅱa型
Ⅱb型
Ⅲ型
Ⅳ型
Ⅴ型
第34页，本讲稿共45页
第35页，本讲稿共45页
第36页，本讲稿共45页
第37页，本讲稿共45页
第38页，本讲稿共45页
第39页，本讲稿共45页
第40页，本讲稿共45页
第41页，本讲稿共45页
第42页，本讲稿共45页
第43页，本讲稿共45页
第9页，本讲稿共45页
琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
(2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
(3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须 立即固定染色。
(4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
第10页，本讲稿共45页
目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DN A鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方 法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已 成为基因工程研究中常用实验方法之一。
第13页，本讲稿共45页
第14页，本讲稿共45页
在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对 的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的 距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未 知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖 凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再 依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分 离DNA时，分子大小不宜超过此值。
实验六-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测ppt课件
实验试剂：0.5×TBE（PH8.0）缓冲液 、1.0%琼脂糖溶液、
.
实验步骤
琼脂糖凝胶的配制
1g琼脂糖
100mlTBE缓冲液
5µl GoldView
冷却到60℃
.
点样
1.将适量的DNA Marker用移液枪加入凝胶的第一个孔中。 2.在PCR产物中加入6×DNA LodingBuffer（每5ul产物加 入1ul），混匀后，用移液枪加入到样品孔内，每孔加2ul。
.
2. DNA分子进行染色的原理（以溴化乙锭为例）
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖凝胶中的DNA分 子。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从 负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌 入到DNA分子中的碱基对之间形成络合物，这种络合物在紫外光下发射的 荧光要比单纯的DNA分子要强的多，便于DNA的检测。
.
电泳、观察
肉眼可见指示剂泳至距制胶板前端约2-3cm处即可停止电泳。切断电源， 取出凝胶，置于紫外线透射仪上观察电泳结果，或用凝胶成像分析系统拍照ห้องสมุดไป่ตู้保存。
.
注意事项
1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。 2. 制胶和加样过程中要防治气泡的产生。 3. 操作过程必须戴手套操作，严格注意防护。 4. 加样时，Tip 头不宜插入样品孔太深，也不要穿破
.
实验原理
（1）电荷效应 DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在
电泳时向阳极移动。
.
（2）分子筛效益 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决
于分子筛效益，即DNA分子本身的大小和构象（共价闭环 DNA>线状DNA>开环DNA），而且其迁移速度与其相对分子 质量的对数值成反比，所以不用相对分子质量的DNA分子可 以在琼脂糖凝胶电泳中分离。