动物乳腺生物反应器
动物乳腺生物反应器
动物乳腺生物反应器黄泠淇 16302010054技术原理乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA技术和转基因技术,将目的基因转移到尚处于原核阶段(或1～2细胞的受精卵)的动物胚胎中,经胚胎移植,得到转基因乳腺表达的个体,其乳腺组织即可分泌生产目的产品进入奶中。
在构建乳腺表达的外源基因时,外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区,即要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列,这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下,使其在乳腺中表达,再通过回收奶得到目的蛋白。
转基因动物乳腺生物反应器建立后尚需进一步鉴定。
可分别从DNA，RNA及表达的目的蛋白等不同水平进行检测，从而确保能得到具有生物活性的目的蛋白。
目的蛋白的分离和纯化的基本路线可以分为：收集转基因动物奶液，离心去脂肪，酸处理去除酪蛋白，盐析、透析、超滤，以及各种层析技术来提纯，最后得到成品。
技术应用工业上，动物乳腺生物反应器主要应用于生产活性蛋白。
大量抗体，抗生素，疫苗被成功生产出来。
腺反应器生产的抗胰蛋白酶，凝血因子更是帮助无数遗传病患者摆脱病痛。
同时经营养改造过的乳腺生产的奶液可以为免疫系统功能不全的人和接受放疗化疗的病人提供优良的营养物质和安全的药物服用途径。
动物乳腺生物反应器除了用于大量生产蛋白质，还是研究基因的理想工具，利用这项技术能够方便研究基因功能，整合，翻译，修饰，表达，调控等。
也为其他生物反应器的研究和商业应用开辟道路。
技术优点1.动物乳腺的表达可进行翻译后修饰，如信号肽切除，蛋白的糖基化，羟基化及羧基化等，相比原核生物生产的外源蛋白，这种方法生产的蛋白具有生物活性和稳定性。
2.这种蛋白表达体系简单，一旦建立转基因动物乳腺生物反应器，只要简单地饲养好动物，利用动物乳腺的高表达能力，即可源源不断地得到贵重的药物蛋白。
3.转基因动物乳腺反应器的生产过程是一个畜牧业过程，饲养费用低廉，对环境没有污染，有广阔的发展前景。
生物乳腺反应器的原理及进展
动物乳腺生物反应器的原理及进展摘要：动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。
利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。
虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。
关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。
1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。
细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本太高,限制了规模生产。
动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。
它是在转基因技术体系基础上发展起来的。
7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多突破，现己成为生物技术研究的热点。
并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。
并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。
21、动物乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。
1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。
动物乳腺生物反应器
动物乳腺生物反应器动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。
乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。
利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。
动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。
（2）易分离提纯，成本低廉。
现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。
而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。
（3）产量高。
外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。
动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。
动物乳腺生物反应器发展简史转基因动物的研究始于20世纪80年代初。
1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。
1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。
此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。
从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。
生物技术制药的研究进展
动物乳腺生物反应器的研究进展班级：生物工程学号：071454116 姓名：刘俊超摘要：动物乳腺生物反应器(Mammary Bioreactor)是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。
该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍，是一种非常有潜力的高新技术。
本文综述了乳腺生物反应器的原理，研究进展与应用。
关键词：乳腺生物反应器；研究进展；应用1乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)技术是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，制作转基因动物，指导外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达，以期从转基因动物乳汁中源源不断地获得外源活性蛋白。
乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段(或1～2细胞的受精卵)的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。
外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达，再通过回收乳汁获得具有生物活性的目的蛋白。
2研究现状2.1国外进展GordonL[l] 等将重组DNA 采用显微注射方法导人小鼠受精卵，首次获得了带有外源基因的转基因小鼠。
Palmiter等[2]将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠的受精卵中，获得比普通小鼠大得多的“硕鼠”，并提出可以从转基因动物中提纯有价值的药用蛋白。
此后，国外在此项技术上不断取得新的进展。
荷兰的Phraming公司[3]培育出含人乳铁蛋白的转基因牛，每升牛奶中含有人乳铁蛋白1 g。
英国爱丁堡制药公司[4]已培育成功含a一1一抗胰蛋白酶(AA T)的转基因羊，每升羊奶中会有此种蛋白30 g。
V elander W H 等L3 报导用转基因猪生产人蛋白C的量为1 g／L。
动物乳腺生物发生器存在的问题
细胞工程动物乳腺生物发生器存在的问题乳腺生物反应器存在的问题◆外源基因在动物体内的位点整合问题◆乳蛋白基因表达组织特异性问题◆目的蛋白的翻译后修饰问题◆转基因表达产物的分离和纯化问题◆转基因的技术和方法问题◆伦理道德问题一、外源基因在动物体内的位点整合问题目前未知乳汁蛋白基因表达调控机理、目的基因在宿主染色体上整合的详细机制；导入基因在动物体内的整合位点不能适宜选择，无法消除基因表达的位置效应，常常出现遗传性状不稳定、病理缺陷等问题，如繁殖力下降、不育、畸形、隐性致死突变、胚胎早期死亡、生理功能紊乱等。
二、乳蛋白基因表达组织特异性问题家畜乳腺对外源基因的表达具有乳腺特异性。
乳腺特异性表达载体一般是选择乳汁蛋白的基因表达调控元件，基因表达调控元件在不同家畜表现差异很大。
这可能与外源基因的类型、宿主的遗传背景以及各种启动子调控结合因子结合位点的突变等有关。
三、目的蛋白的翻译后修饰问题乳腺细胞对蛋白质的加工修饰机理等还未弄清；转基因动物能够对外源蛋白进行翻译后修饰，但机体的保护系统会对一切外源物质产生排斥作用，如可能出现蛋白水解、羟基化不充分、糖基化形式与人类不同等。
四、转基因表达产物的分离和纯化问题表达产物往往纯化的含量低，且要去除所有可能引起人类变态反应的蛋白质，否则产品就会与人类产生的蛋白结构、功能和理化性质存在差异，产生免疫反应。
五、转基因的技术和方法问题显微注射是目前实验室生产转基因动物的常用方法，但在反刍动物上成功率比较低，只有4%左右，且操作复杂，很难在短时间内生产出大量转基因动物。
其他方法如电转化、精子载体法尚处于探索阶段，因此还需要建立一套更有效的转基因方法。
六、伦理道德问题基因的种间转移，很多人拒绝使用转基因产品；转基因动物对现有物种造成威胁制约了转基因技术的发展；转基因动物回归自然，对现有的生态平衡是否会造成重大影响等。
在乳腺反应器研制中还存在下述待解决的难题◆目的蛋白的表达水平远低于乳汁中总蛋白含量。
《转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究》范文
《转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，转基因技术已成为生物医药领域的重要研究手段。
其中，利用转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究，为糖尿病治疗提供了新的可能。
本文将详细介绍此项研究的背景、目的及意义。
二、研究背景及目的人胰岛素是治疗糖尿病的主要药物，然而传统的人胰岛素生产方法主要依赖于生物合成，产量低、成本高，无法满足日益增长的临床需求。
近年来，通过将外源基因导入动物乳腺以实现生物制药的方法引起了广泛关注。
牛乳腺具有产量大、可实现持续性表达等优点，使得其在制药工业中的应用越来越广泛。
因此，本研究的目的是通过转基因克隆技术将人胰岛素基因植入牛的乳腺中，实现人胰岛素在牛乳腺中的高效表达。
三、研究方法本研究采用转基因克隆技术，具体步骤如下：1. 构建人胰岛素基因表达载体：通过基因工程技术构建人胰岛素基因表达载体，使其能够在牛乳腺细胞中表达人胰岛素。
2. 牛胚胎细胞培养与转染：将构建好的表达载体转染至牛的胚胎细胞中，使其获得外源基因的表达。
3. 胚胎移植与克隆：将转染后的胚胎细胞进行胚胎移植，获得转基因牛。
通过克隆技术对转基因牛进行基因鉴定，以确保其具有所需的转基因表达特性。
4. 验证及评估：通过对转基因牛乳腺细胞的基因和蛋白质表达进行验证及评估，分析人胰岛素在牛乳腺中的表达情况。
四、实验结果及分析经过上述实验过程，我们成功获得了转基因克隆牛，并对其进行了基因和蛋白质水平的验证及评估。
结果显示：1. 基因水平验证：通过PCR技术对转基因牛的基因进行扩增和测序，证实了人胰岛素基因已成功整合到牛的基因组中。
2. 蛋白质水平验证：通过ELISA技术检测牛乳腺组织中的人胰岛素含量，发现人胰岛素在牛乳腺中得到了高效表达。
同时，通过对胰岛素蛋白进行分离纯化及质量鉴定，证明该胰岛素蛋白与正常人胰岛素在结构和功能上具有相似性。
3. 表达量评估：通过长期监测和统计分析，我们发现人胰岛素在转基因牛乳腺中的表达量较高且稳定，满足了大规模生产的需求。
动物乳腺生物反应器研究进展
动物乳腺生物反应器研究进展摘要介绍了动物乳腺生物反应器的概念,综述了动物乳腺生物反应器及其载体的发展现状,以为动物乳腺生物反应器进一步研究提供借鉴。
关键词动物乳腺生物反应器;表达载体;发展现状1动物乳腺生物反应器的概念动物乳腺生物反应器(Mammary gland bioreactor)属于转基因动物范畴,其原理是通过转基因技术,将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因,在动物乳腺组织高效表达,通过乳汁分泌到体外,该方式不会对动物自身机体造成损害,通过回收乳汁就可以提取有重要价值的生物活性蛋白。
通常情况下,这种外源蛋白的特异性表达方式更安全、可靠。
2动物乳腺生物反应器表达载体的发展外源基因在动物乳腺中高效表达有2个前提:一是选用的调控元件要能指导目的基因在乳腺中高效、特异性表达,并且表达产物能分泌到乳汁中;二是整合到动物染色体基因组中的表达载体要处于开放和活跃转录状态,而这2个前提都归结于表达载体的成功构建[1]。
2.1基于普通质粒的表达载体哺乳动物的染色体是由许多独立、分散的区域组成,区域内含有单个或多个转录单元,包括调控基因表达的所有控制元件。
乳蛋白基因以独立区域的形式存在于染色体上。
对乳蛋白区域进行调控的一些重要控制元件可分为三类:①调控基因转录的元件,包括启动子、增强子和激素应答元件。
乳蛋白的启动子和增强子在大多数情况下位于转录起始位点数百个碱基处的5’侧翼区,有时可远至10kb。
乳蛋白激素应答区的表达受催乳素、胰岛素、糖皮质激素及细胞间质的诱导。
②具有使染色体变构和开放功能的元件,有位点控制区和核基质黏附区,主要用于对抗位点效应。
位点控制区位于5’远端,是大区域的DNaseI高敏区。
位点控制区包括多个DNaseI高敏区,各个高敏区与其反式因子结合成一个单元,然后对启动子复合物起作用。
因此,一般认为位点控制区具有增强子和绝缘子的双重功效[2]。
核基质黏附区也起到绝缘子的作用,并且还具有转录增强活性,多数位于区域的两端,可以把区域拴在核基质上。
动物乳腺反应器
blot results of the different samples as they correspond to SDSPAGE
17
6 The stability of the rhLF in artificial gastric solution and intestinal juice
Purification of the rhLF, using cation exchange chromatography: peak 1 and peak 2, protein peak
15
M: marker; 1: skimmed milk; 2:defatted whey without casein; 3: sample of peak 1; 4: sample of peak 2; P: natural hLF (5 μg).
SDS-PAGE results of the hLF (a) and rhLF (b) digested in stimulated gastric solution
18
M:
marker; lanes 1–2: 10 min; lanes 3–4: 30 min; lanes 5–6: 1 h; lanes1, 3, 5: hLF; lanes 2, 4, 6: rhLF
28
bovine lactoferrin
no statistical differences were observed between the groups.
transgenic cows ( ) control cows ( )
29
Serum amyloid A
• In the transgenic group, mean SAA was lower throughout the study period and never exceeded 15 mg/l
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THANK YOU FOR LISTENING
Q1
作为高技术产业的动物乳腺生 物反应器， 一头牛或一只羊 就是一个制药车间，其经济效 益肯定非常好。
Q2
但，需要慎重发展。
根据你掌握的知识，在5～10 年内动物乳腺生物反应器生产 的药物与传统制药相比，哪个 产业更大？
Q3
重组蛋白活性高
药物蛋白产量高
对动物影 响小 环境 污 染低
生产成 本低
动物乳腺生物反应器 与新产业发展
动物乳腺生物反应器 的关健技术有哪些？
动物胚胎技术
表达载体
转基因技术
蛋白质提纯技术
常规畜牧技术
转基因技术
以体细胞克隆技术 显微注射技术 精子载体技术 胞内精子注射技术（CSI） 逆转录病毒侵染技术 动物体细胞核移植技术
假若现在有审批合格的动物乳 腺生物反应器产品，你愿意使 用吗？
经济回报 丰厚
由于动物乳腺生物反应器的关 健技术需要转基因技术，根据 人们目前对转基因产品的反应， 动物乳腺生物反应器作为可能 的新产业
高技术会解决相关疑问，动物 乳腺反应器新产业会大发展
Q4
•
乳腺生物反应器生产重组蛋白的优势 动物乳腺生物反应器的核心是通过乳腺组织特 异性启动子驱动的外 源基因在动物乳腺组织中高效 特异地表达，从乳汁中获取目的产物。与其他制药 方式相比，它具有多方面 的优势：
• (1)重组蛋白活 性高。动物乳腺可对表达的蛋白质进行糖基化、脂 化、磷酸化、羧化等一系列后加工，产品 接近天 然提取物。 • (2)药物蛋白产量高。乳腺可将外源基因 表达到每升几克到几十克。 • (3)生产成本低。一头转 基因动物相当于一个制药车间，况且转基因动物可 无限繁殖，易于扩大生产规模， 饲养成本低，费 用主要用于产品提纯。 • (4)生产条件简单。 • (5)无环境 污染。乳腺生物反应器产业基本上是一个畜牧业过 程；产品纯化过程中没有毒性物质或有害物质 释 放。 • (6)对动物影响小。乳腺是一种外分泌腺，外 源蛋白质很少进入循环系统，这可避免大量表达的 外源性蛋白 对动物健康造成的危害。 • (7)缩短新药上 市周期。利用乳腺反应器来生产蛋白新药，开发周 期将缩短10 年左右。 • (8)经济回报丰厚。用传统的细胞培养来生产1克基因药物，平均成本为100~1 000 美元，而利用转基因动物 乳腺反应器来生产，则只 需 10~25 美元