不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较
两种不同痰液标本采集模式对比分析
两种不同痰液标本采集模式对比分析摘要：目的：探讨两种不同痰液标本采集模式对比分析。
方法：以2014年2月~2014年6月作为研究阶段，收集该时间段内我院门诊部采集有痰液标本的患者共计400例作为研究对象，按照数字随机表方法进行分组，200例患者纳入对照组，200例患者纳入观察组。
对照组通过深度咳嗽的方式采集痰液标本。
观察组通过氨溴索雾化吸入的方式采集痰液标本。
结果：观察组痰液标本采集成功率为95.00％（190/200），标本合格率为88.00％（176/200），均明显高于对照组，组间数据对比差异显著，P＜0.05，具有统计学意义。
结论：采取氨溴索雾化吸入的方式采集痰液效果确切，较常规的深度咳嗽排痰而言，其采集成功率较高，采集标本合格率较高，临床效果较好。
关键词：痰液；标本采集模式；对比分析在临床检验实践中，检验人员常需要通过对痰液标本进行细菌培养的方式，明确诱发呼吸道感染疾病的病原菌，从而为临床治疗与用药提供一定的依据。
在检验中，痰液标本的正确采集会直接影响标本的检验分析结果。
为最大限度的杜绝因标本采集不当而出现的检验误差，就需要通过临床实践的方式，对痰液标本的采集模式进行改进优化，选择合理的采集模式，提高采集的合理性与精确性。
为指导临床选择合理的痰液标本采集模式，本研究中以2014年2月~2014年6月作为研究阶段，收集该时间段内我院门诊部采集有痰液标本的患者共计400例作为研究对象，对比分析深度咳嗽排痰与氨溴索雾化吸入两种模式的采集效果，具体数据报告如下：1 资料与方法1.1 一般资料以2014年2月~2014年6月作为研究阶段，收集该时间段内我院门诊部采集有痰液标本的患者共计400例作为研究对象，按照数字随机表方法进行分组，200例患者纳入对照组，200例患者纳入观察组。
对照组中，男性患者共计125例，女性患者共计75例，患者年龄在20~80周岁范围内，平均年龄为（51.2±1.6）岁；观察组中，男性患者共计120例，女性患者共计80例，患者年龄在20~80周岁范围内，平均年龄为（50.3±1.9）岁。
三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究
三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究王聪;陈之遥;武海萍;周国华【摘要】目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异.方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV 阴性血清样本均取自南京军区南京总医院.样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR.结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低.结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同.对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒.如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒.%Objective To compare the efficiency of different nucleic acid extraction kits for extracting blood virus.Methods 3 commonly used kits for extraction of blood viral nucleic acid were chosen from domestic and international markets, including OMEGA kit, QIAGEN kit and WATSON kit, and serum samples with or without Hepatitis B virus (HBV) and serum samples with or without hepatitis C virus (HCV) were selected from General Hospital of Nanjing Military Area Command. The nucleic acid extraction procedures were carried out according to the instructions of the 3 kits and the real-time quantitative PCR was performed for quantitative analysis. Results OMEGA kit had the best extraction efficiency of DNA but had the worst extractionefficiency for RNA extraction within a short time and at medium cost. QIAGEN kit had good efficiency for both DNA and RNA extraction with medium term, but at the highest cost; WATSON kit had medium efficiency rate for both DNA and RNA extraction with long term extraction and at the lowest cost. Conclusion There are different efficiency rates at the in extracting blood virus with different nucleic acid extraction kits. We should choose kits for the samples with clear virus capacity and category according to the concentrations of extracted DNA and RNA, but for the samples with unknown capacity and category of virus, QIAGEN kit should be the first priority and followed by WATSON kit. WATSON kit should be the first choice in terms of cost.【期刊名称】《临床误诊误治》【年(卷),期】2011(024)008【总页数】4页(P6-9)【关键词】病毒核酸提取试剂盒;实时荧光定量聚合酶链反应;提取效率【作者】王聪;陈之遥;武海萍;周国华【作者单位】210009,南京,中国药科大学生命科学技术学院;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210002,南京,华东医学生物技术研究所;210009,南京,中国药科大学生命科学技术学院;210002,南京,华东医学生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】R457.11随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性已大大降低，但由于病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低载量病毒感染等因素，使得临床输血依然存在一定风险。
三种核酸的提取与比较
三种核酸的提取及比较摘要：分别以绿豆芽幼叶、含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基培养的细菌和绿豆芽幼叶为材料进行总DNA、质粒DNA和RNA的提取的试验比较，结果表明：用上述的材料可以提取到较高质量的总DNA,质粒DNA和RNA。
关键词：总DNA，质粒DNA，RNA，提取，检测，电泳现在，对基因组DNA,质粒DNA,RNA含量的研究已经是成为一种普遍。
大豆作为我国乃至全世界重要的作物，国内外已开展了大量的基础生物学研究和分子辅助育种研究，以绿豆幼叶提取基因组DNA、以绿豆幼叶提取RNA，是一种不错的选择，因为在大豆幼嫩叶片中有高含量的DNA，对于基因组DNA、RNA 的全部提取实现率较高。
而质粒DNA的提取，我们则选用了、含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基培养的细菌为材料。
1材料与仪器1.1 实验材料豆芽，LB培养基菌体1.2 仪器设备高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、冰箱、移液枪、PH试纸、高压灭菌锅、电泳槽等2 试剂2.1总DNA提取的试剂2.1.1 裂解液100mmol/L Tris-HCL（pH8.0），5mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.25%SDS，1%巯基乙醇，1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。
2.1.2 苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）2.1.3 3mol/L NaAc(用冰醋酸调PH至5.2)2.1.4 TE缓冲液100mmol/L Tris-HCL（pH8.0），10mmol/L EDTA，配成母液储存。
使用前稀释10倍成为工作液。
2.1.5 异丙醇2.1.6 氯仿2.1.7 5mg/mL Rnase，用水溶解后煮沸10至15min，冷却后贮于-20°C备用。
2.2 质粒DNA提取的试剂2.2.1 溶液I 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL(pH8.0),10mmol/L EDTA,灭菌后保存于冰箱中备用。
核酸抽提经验及原理总结
核酸提取原理及经验总结一、核酸核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。
一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。
今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。
一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。
核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。
他当时称之为核素。
阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。
二、核酸的分类和功能核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。
这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。
碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。
DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。
核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。
下面我们看看DNA和RNA具体的差别：（一）DNA的分子结构1. DNA的碱基组成规律：Chargaff等根据分析各种生物及其不同组织内DNA样品水解液中的碱基含量的结果，得出以下结论：1）同一生物不同组织的DNA样品，其碱基成分含量相同。
2）不同生物的DNA 碱基成分含量不同。
3）对某一生物讲，其碱基成分的含量不受年龄、营养及环境变化等影响。
4）在同一生物的DNA碱基含量是A=T，G=C，A+G=C+T ，碱基之间的这种关系称Chargaff法则。
2. DNA分子的基本结构：核酸分子内单核苷酸之间的连接键为3',5'-磷酸二酯键，是共价键。
DNA分子的基本结构就是许多脱氧核糖核苷酸借磷酸二脂键相互连接而成的多核苷酸链。
核酸提取方法进展
核酸提取方法进展一、本文概述核酸，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生命体系中承载遗传信息的核心分子。
因此，核酸的提取和分析在生物科学研究、疾病诊断、法医鉴定等领域具有极其重要的意义。
随着科学技术的不断进步，核酸提取方法也经历了从传统的繁琐复杂到现代的高效精确的变革。
本文旨在综述核酸提取方法的发展历程、现有技术的优缺点以及未来可能的研究方向，以期为相关领域的研究人员和技术人员提供有益的参考。
本文将首先回顾核酸提取技术的基本概念和发展历程，然后重点介绍当前主流的核酸提取方法，包括机械法、化学法、酶解法等，并探讨这些方法的原理、优缺点及适用范围。
本文将展望核酸提取技术的发展趋势，以期推动该领域的技术创新和应用拓展。
二、传统核酸提取方法核酸提取是生物化学研究中的关键步骤，对于后续的基因克隆、表达分析、测序等工作具有至关重要的作用。
传统核酸提取方法主要包括酚氯仿抽提法、硅珠法、磁珠法等。
这些方法各有其优缺点，适用于不同的样本类型和实验条件。
酚氯仿抽提法是最早用于核酸提取的方法之一。
它利用酚和氯仿的有机溶剂特性，通过反复抽提和离心，去除样本中的蛋白质和其他杂质，从而得到纯净的核酸。
该方法操作简便，成本低廉，但对于一些含有大量蛋白质或脂质的样本，提取效果可能不佳。
硅珠法是一种基于硅基质吸附原理的核酸提取方法。
硅珠表面带有大量负电荷，能够通过静电作用吸附带有正电荷的核酸分子。
通过洗涤和洗脱步骤，可以实现核酸的纯化。
硅珠法具有操作简便、提取效率高等优点，但成本相对较高，且对于某些特殊样本可能效果不佳。
磁珠法则是一种结合了磁场分离技术的核酸提取方法。
磁珠表面修饰有特异性识别核酸的基团，能够在磁场作用下快速分离和纯化核酸。
该方法具有自动化程度高、操作简便、提取效率高等优点，但成本也相对较高，且需要特殊的磁分离设备。
传统核酸提取方法各有其优缺点，需要根据具体实验需求和样本类型进行选择。
随着科学技术的不断发展，新型核酸提取方法不断涌现，为生物化学研究提供了更多的选择和可能性。
新型冠状病毒肺炎病例痰标本和鼻咽拭子标本病毒核酸检测效果比较
• 100 .江苏预防医学 2021 年 1 月第 32 卷第 1 期 Jiangsu J Prev M ed,Jan.,2021，Vol. 32,No. 1最短在4 d ，最长为17 d ，米样间隔>24 h 。
2. 2病毒基因O R F lab 检测分别对5病例痰和鼻 咽拭子标本2019-nC()V O R F lab 基因进行实时荧光 P C R 检测，部分检测图谱如图1(曲线1、2分别代表痰 和鼻咽拭子标本）所示。
（)R F la b 基因在痰标本中有 明显的扩增曲线，鼻咽拭子标本扩增曲线信号明显弱于痰标本，痰标本的C T 值小于鼻咽拭子标本，E 病例 痰标本检出而鼻咽拭子标本未检出，见表1。
400「 300 200 100 ■核酸检测是确诊新型冠状病毒肺炎（a )v ii >i 9) 病例应用最广泛的标准[1]，快速、准确的病原学核酸 检测非常重要。
检测标本有鼻咽拭子、痰和其他下呼 吸道分泌物、血液和粪便等，首选下呼吸道标本W ，而 鼻咽拭子是目前最常用、最易得到的检测材料。
为评估不同类型标本核酸检测效果，本文对C ()VII >19病 例痰和鼻咽拭子标本分别进行核酸检测并比较。
1材料与方法1.1材料收集新乡市5例C ()VII >19疑似病例同一 天的痰和鼻咽拭子标本。
仪器：天隆NP 968核酸提取 仪、CFX 96PC R 扩增仪。
试剂：天隆免疫磁珠核酸提取 试剂、上海伯杰2019-nC ()V 双通核酸检测试剂盒。
1.2 方法将痰标本用1. 5 m l 的P B S 和1. 5 m l 的 病毒保存液稀释，振荡器中均质10 min ;分别吸取痰 标本上清液与鼻咽拭子各200采用免疫磁珠核酸提取试剂盒提取病毒R N A ，按照2019-nC ()V 双通核 酸检测试剂盒说明书•配制体系检测病毒（)R F la b 基 因、N 基因；设定检测程序为50 °C 10 min 、95 °C 5 min ，95 °C 10 s 、55 °C 40 s (荧光检测）、40 循环，设 置检测通道FA M 、H E X 进行双靶标基因（O R H ab 、 N )检测，按照试剂说明书判读样本结果。
几种核酸提取方法概述
几种核酸提取方法概述第一篇：几种核酸提取方法概述几种核酸提取方法概述(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。
此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态. 第二篇：核酸的提取核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
核酸的提取
核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质(一)DNA提取的经典方法DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。
因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。
说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。
沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。
另：异丙醇、醋酸钠等。
70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl1mmol/L EDTA pH 8.5或8RNA的提取RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。
RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。
这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。
除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。
1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。
玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。
DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。
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ａｄｖｅｒｓｅ ｉｍｐａｃｔ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
ＣＯ—ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ・
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｌｏｎ Ｓｐｕｔｕｍ；Ｓｐｕｔｕｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ；ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ＣＯ－ｅｘｔｒａｔｉｏｎ；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｓｐｕｔｕｍ ｗａｓ ｌｉｑｕｅｆｉｅｄ ｂｙ Ｏ．１％Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
（ＤＴＦ）（ｇｒｏｕｐ Ｂ）ａｎｄ ４％ＮａＯＨ（ｇｒｏｕｐ Ｃ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ｇｒｏｕｐ Ａ）．ＴＩＡＮａｍｐ Ｖｉｒｕｓ
ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ １），ＫＢＷ ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ ２），ＫＢＷ ｕｎｉｖｅｒａｌ ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ ３）ａｎｄ ＴＡＫＡＲＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ
Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＣＯ・ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｎ
ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ＣＯ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
ｓｐｕｔｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
（何慧、陈懿、潘平、余道军）；３２２０００浙江义鸟，浙江大学医学院附属第四医院检验科
（潘富根） 通信作者：余道军，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｄａｏｊｕｎ９８＠１６３．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１４９．２０１６．０２．００３
【摘要】目的
比较不同痰液液化方法及不同核酸提取方法共提取痰液中病毒ＲＮＡ和ＤＮＡ的效果，并 ＤＮＭＲＮＡ Ｋｉｔ（方法１）、ＫＢＷ酶法（方法２）、ＫＢＷ通用法（方法３）和单一核酸提取试
Ｙ，Ｐ弧Ｐ。Ｙｕ Ｄｎ；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ ３２２０００，ｇｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ（Ｐａｎ ＦＧ）
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｇｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎ＆ｅｒｓ毋Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ胁如妇，Ｙｉｗｕ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｙｕ
Ｄ晒ｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｄａｏｊｕｎ９８＠１６３．ｃｏｍ
ｒａｎｇｅ．Ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ
万方数据
・８２・
国际流行病学传染病学杂志２０１６年４月第４３卷第２期Ｉｎｔｅｒ Ｊ
Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ—Ｉｎｆｅｃｔ Ｄ—ｉｓ，Ａｐｒｉ—ｌ ２０１６，Ｖｏ—１．４３，Ｎｏ．２
ｗａｓ
ｎｏ
ａｃｉｄ ｂｖ ｍｑＰＣＲ：ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅ（ＤＮＡ）Ｃｔ ｖａｌｕｅ：ｇｒｏｕｐ Ａ＜ｇｍｕｐ
国际流行病学传染病学杂志２０１６年４月第４３卷第２期Ｉｎｔｅｒ Ｊ
Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ＇Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｖ０１．４３．Ｎｏ．２
・８ｌ・
・论著・
不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中 病毒核酸的提取效果比较
何慧
陈懿
潘平
潘富根余道军
３１０００６杭州，浙江中医药大学附属杭州第一医院检验科，杭州市第一人民医院检验科
理委员会审核［２０１５科研伦理审第（２６）号一Ｏｌｌ。 二、试剂及仪器 二硫苏糖醇（ＤＴＦ）、ＲＮＡ酶（上海源叶公司），
ＤＮａｓｅ
床病毒感染的检测，其中多重荧光定量ＰＣＲ更适合
于多种病毒混合感染的鉴别诊断【２】。应用多重ＰＣＲ 检测病毒的关键在于核酸提取，有关病毒ＤＮＡ和 ＲＮＡ提取试剂盒众多，但多只能提取单一种类核 酸，但常见呼吸道病毒往往包括多种病毒核酸，如 腺病毒（ＡＤＶ）为ＤＮＡ病毒，而呼吸道合胞病毒 （ＲＳＶ）等为ＲＮＡ病毒，其重要性相当，因此如何从 同一份痰样本中同时提取ＤＮＡ和ＲＮＡ具有重要 意义。本研究比较３种核酸共提取试剂盒从痰样本 提取核酸的效率，并对其中的核酸浓度及纯度进行 对比研究，同时研究不同液化方法对痰液核酸提取 效率的影响，从而对ＰＣＲ技术检测临床痰液样本 核酸的处理方法做优化选择，为多重ＰＣＲ技术同 时检测ＤＮＡ和ＲＮＡ病毒寻找更精确、高效的试剂 盒提供依据。 材料与方法 一、样本来源 收集杭州市第一人民医院２０１４年１１月至 ２０１５年２月经直接／间接免疫荧光法检查ＡＤＶ或 ＲＳＶ阳性的儿科患者痰液样本共２５份，将痰液混 合，使用生理盐水补足至５０ ｍＬ，取１ ｍＬ用普通 ＰＣＲ方法扩增，送上海生工生物工程公司测序验证 混合痰液中含ＡＤＶ和ＲＳＶ。痰样本取得过程征得 患儿家长同意，并通过杭州市第一人民医院医学伦
Ｖｉｒｕｓ
ＤＮＭＲＮＡ
Ｋｉｔ（ＤＰｌ３０４２３ＴＩＡＮＧＥＮ公司）、ＫＢＷ酶法Ｋｏｎｉｎｇ
通用型酶法体液病毒ＤＮＡｍＮＡ小量制备试剂盒
（Ｃ３６１２杭州百迈生物技术有限公司）、ＫＢＷ通用 法Ｋｏｎｉｎｇ通用型体液病毒ＤＮＭＲＮＡ小量制备试 剂盒（Ｃ４６１２杭州百迈生物技术有限公司）、ＲＮＡ提 取试剂盒（９７６７ ＴＡＫＡＲＡ公司）。 三、方法 １．不同液化方法 将混合痰液平均分为３管，标记为Ａ、Ｂ、Ｃ。Ａ 管为生理盐水组，Ｂ管为Ｄｒｒｒ处理组：１０
Ｃ（ｑ＝３５．０９，Ｐ＜０．０５），ａｎｄ ｔｈｅｒｅ
ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ
ｎｏ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
舯ｕｐ Ａ ａｎｄ
Ｂ（ｑ５２．５４，Ｐ＞０．０５）；ｍｅｔｈｏｄ
１＜ｍｅｔｈｏｄ
３（ｑ＝１２．６８，Ｐ＜０．０５），ａｎｄ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ １，２
（ｍｅｔｈｏｄ ４）ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ
ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ
ｎａｎｏ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ
ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｓｔｅｒ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＷａＳ
０００
ｘｇ离
ｍｉｎ，
心５ ｒａｉｎ，去上清，加０．１％Ｄ７ｒｒ至１０ ｍＬ处理２０
１０
０００ｘｇ离心５ ｒａｉｎ，沉淀用１－ｘＰＢＳ缓冲液混匀洗
涤１次，最后用１ｘＰＢＳ补足至１０ ｍＬ。Ｃ管为ＮａＯＨ 处理组：１０ ０００ｘｇ离心５ ｍｉｎ，去上清，加４％ＮａＯＨ
至１０ ｍＬ，静置５ ｒａｉｎ，１０ ０００ｘｇ离心５ ｍｉｎ，去上清，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｐ１ａｎ（２０１３０７３３Ｑ０４）；Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ
ｏｆＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎ（２０１２ＺＤ００１）
病毒感染易导致儿童急性呼吸道疾病，据统计 在婴幼儿中，约５０％的肺炎是由病毒引起的ｕ１。随着 分子诊断技术的不断发展，ＰＣＲ技术开始应用于临
ａｎｄ４（口－ｏ．８４，１．６９，２．５３，Ｐ＞Ｏ．０５）；ｔｈｅ
ｗｈｉｌｅｍｅｔｈｏｄ １＜ｍｅｔｈｏｄ ２＜ｍｅｔｈｏｄ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓｅ（ＲＮＡ）Ｃｔ
ｖａｌｕｅ：ｇｒｏｕｐＡ＜ｇｒｏｕｐＢ＜ｇｒｏｕｐＣ（砖１５２．７６，Ｐ（ｏ・０１），
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎｍｅｔｈｏｄ ２ ａｏｆ ＲＮＡ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｈｉｇｅｒ ｔｈａｎ ２ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ １ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ Ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ １．８ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ４ ｉｎ
ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ３ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ；ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ
比较其优劣。方法将痰液样本分为二硫苏糖醇（ＤＴｒ）、氢氧化钠（ＮａＯＨ）液化痰液组，以生理盐水为对照，分 别使用ＴｌＡＮａｍｐ
Ｖｉｒｕｓ
剂盒（方法４）提取核酸，微量核酸分析仪检测核酸纯度，多重定量ＰＣＲ方法检测核酸的浓度。结果核酸纯度 测定结果：生理盐水组中方法２和方法３，ＤＴｒ处理组中方法ｌ和方法２，ＮａＯＨ处理组中方法３所提ＤＮＡ纯 度略大于１．８；各组中采用方法１所提ＲＮＡ纯度均明显超过２，方法４及ＮａＯＨ处理组中方法３所提ＲＮＡ纯 度均低于１．８，其余纯度均在正常范围内。ＰＣＲ浓度测定结果：腺病毒（ＤＮＡ）Ｃｔ值：生理盐水组＜ＮａＯＨ处理组 （ｑ＝３５．０９，Ｐ＜０．０５），生理盐水组和Ｄ．Ｉ’Ｉ’处理组间差异无统计学意义（ｑ＝２．５４，Ｐ＞０．０５）；提取方法ｌ＜方法３（ｇ＝ １２。６８，Ｐ＜０．０５），方法１、方法２与方法４之间差异无统计学意义（ｑ＝０．８４、１．６９、２．５３，Ｐ＞０．０５）；呼吸道合胞病毒 （ＲＮＡ）Ｃｔ值：生理盐水组＜ＤＴＦ组＜ＮａＯＨ组（Ｆ＝１５２．７６，１９＜０．０１）；提取方法１＜方法２＜方法３（ｑ＝６．９８、３．７５，Ｐ＜ ０．０５），方法２与方法４之间差异无统计学意义（ｑ＝１．２８，Ｐ＞０．０５）。结论痰液液化前处理会影响病毒ＲＮＡ和 ＤＮＡ的共提取，ＴＩＡＮａｍｐ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＭＲＮＡ Ｋｉｔ和ＫＢＷ酶法对痰样本中病毒核酸共提取效果较好。 【关键词】痰；痰液液化；核酸共提取；多重定量ＰＣＲ；腺病毒；呼吸道合胞病毒 基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（２０１５ＺＤＡ０２５）；杭州市科技发展计划（２０１３０７３３Ｑ０４）；杭州市 卫生科技计划重大项目（２０１２ｚＤ００１）
Ｄａｏｊｕｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ ＡＪ毋ｌｉｃａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ