凝胶色谱柱操作上课讲义
凝胶渗透色谱讲课文档
Hostavin N30
Column:
2xPLgel 3µm MIXED-E
Flow rate:
1.0ml/min
Injection volume: 20µl
Detector:
PL-ELS 1000
Eluent Modification in Organic GPC - Acids
▪ Some acidic samples
谱被称作 传统GPC
第30页，共55页。
RI/V 检测器结合使用
VI的响应值正比于 C H / M = C []
H，大分子的尺寸；流体力学体积 [] = VI / RI，特征粘度(intrinsic viscosity)
普适校正的假设：
具有同样大小(H)的大分子应有同样的洗脱体积， 即依赖性
– H = MST [] ST
for each standard
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
Mn：用渗析计测出(Osmometry) Mw：用光散射计测出(Light Scattering) Mv：用粘度计测出(Viscometry) Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
▪ Can cause peak shape
variation due to mismatch in pore volume
聚合物色谱中的检测器
浓度
响应值正比于浓度C 实例：示差(refractometer)检测器
N = (dn/dc) C
紫外检测器
蒸发光散射检测器
使用单一浓度型检测器的体积排除分离模式色
凝胶色谱的讲义第一章(1)
凝胶色谱的讲义第一章(1)第一章前言一、高聚物及多糖平均分子量及其分布1、高聚物的平均分子量除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。
每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。
另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。
高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。
例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI 的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。
下面是四种最常用的平均分子量定义：这里：YMx分子量名称Mn数均分子量1Mw重均分子量2MzZ均分子量3MZ+1Z+1均分子量Mw/Mn分子量分布Mp峰位分子量另外，粘均分子量：很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。
一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：Mz＞Mw ＞M η＞Mn 2．高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。
例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为W1 、W2、W3 、…、Wi 时，我们就可以用对应的W和M作图，得到分子量分布曲线。
凝胶层析法课件
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性
1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min溶剂为甲
苯
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（三）流动分离理论
红细胞在毛血细管中流动时比血浆 流得快。
较大的分子较先通过或绕过这个填 料颗粒，使溶质能按其大小进行分 离。
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第十五页，本课件共有133页
分离过程
三种不同分子量物质的 混合样品用某种规格的 凝胶柱进行分离。
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第三十二页，本课件共有133页
国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、吸附层析 和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、 激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、 氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
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（二）葡聚糖凝胶离子交换剂
骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使 呈亲脂性，同时保留亲水性。
这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。 这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇 为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用 氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与 羧基的化合物却有吸附作用 。
样品加入，以水或其他 溶液进行洗脱，即得洗 脱曲线 。
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第十六页，本课件共有133页
分离过程
最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒
内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其 流经体积最小，等于外水体积V0。
最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自
由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经体积是外水
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质 分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
生物制药工艺学课件讲稿—凝胶层析
第七章凝胶层析定义：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的层析（色谱）方法，又叫扩散层析，排阻层析，分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。
一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶层析分离的基本原理如下：凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。
第——部分是全排阻分子，也可称之为上限分子，是不能起筛分作用的大分子。
第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。
第三部分是全渗透分子，称之为下限分子，是不能起筛分作用的小分子。
如图2—27所示。
从图2—27可以看出，A—B之间为该凝胶的有效分离范围．可分离相对分子质量范围是103一105，高于相对分子质量为105的是全排阻分子，低于相对分子质量为105的是全渗透分子。
二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totle volume)表示，单位为m1。
(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积、空隙体积，以Vo(outer volume)表示，单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积，以V i(inner volume)表示，单位为ml。
(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积．也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积，以Vg(gel volume)表示，单位为ml。
色谱柱原理及使用ppt课件
（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～ 95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去 除柱内空气） （5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上 [或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗 1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是 老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流 动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过 渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内 析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
+
色谱柱原理及使用
பைடு நூலகம்
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1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤
片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用 于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
凝胶渗透色谱GPC课件
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GPC色谱柱选择
按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系 列
THF、氯仿、 DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围 内，并且最好是处在校正曲线线性范围内
2
标样
聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)
将公式(2)代入公式(3)和(4)，则：
(5)
(6)
标样的Mw和Mn已知，将Hi,Vi代入，软件自动算出A,B值。
3
GPC分析大致步骤
根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标 样，并且确定采用的GPC校正方法
配制标样和样品，用LCsolution进样得到色 谱图
用LCsolution GPC生成校正曲线并计算样 品平均分子量，制作报告
渐进试差法(宽分布标样校正法)
这种方法不需要窄分布样品，其标样可为1~3 个不同相对分子质量的宽分布标样(平均相对
2
分子质量精确测量， Mw和Mn为已知)，采用
窄分布标样校正法
要有5个以上的不同分子量的单分散标样来 制作校正曲线
样品最好与标样是相同的结构。
如果样品与标样结构完全一样，则结果不需再 修正
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质
标样数量最少可以只有1个 标样的分子量Mw和Mn必须已知 标样校正曲线呈线性
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
在一定条件下，有： (1)
将标样色谱峰分成若干个切片，则： (2)
根据定义，有：
(3)
(4)
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分 布曲线；
PLgel凝胶色谱柱使用指南.
PLgel凝胶色谱柱使用指南为了尽可能延长一根凝胶色谱柱的寿命，请在使用前仔细阅读本说明。
本说明仅针对PL公司的PLGel凝胶色谱柱，如果您使用的是其它类型或其它公司的凝胶色谱柱，请注意并不是所有内容均适用。
柱子安装一般使用1/16”不锈钢管来连接柱子，0.010”内径适用于分析柱，0.020”内径适用于制备，连接管线应该尽量短来避免死体积，会造成系统性能下降。
柱连接接头应使用与Parker 兼容的1/16”锥箍和螺母，详见图1，请按照GPC柱的使用方向来连接，螺母应当在手拧紧后用扳手再拧1/4圈就足够了，过分拧紧并不会改善密封，反而会损坏螺纹造成泄漏。
图 1Compatible Connectors在图1中的X＝0.090”，约等于2.28毫米，螺母的最小长度应为0.210”，约为5.33毫米，请不要使用Waters和Rheodyne公司的产品，他们与PL的柱子并不兼容。
图 2在安装柱子时，请不要将扳手放在图2所示X处，应当放在柱未端六角处。
在与其它的柱子相连之前，建议将柱子与泵相连，用少量流动相清洗一下连接管内部和接头。
流速对于传统的7.5毫米内径的GPC柱子，1.0ml/min是一个最优化的流速，当柱子的内径增加或减少时，应当适当调整体积流速来保证等效的线速度。
表1给了大家一个推荐的流速，然而对于一些高粘度的流动相，应当适当减小或升高温度，如果要更换溶剂，流速要逐渐升高，无论如何，都不要在超过柱子的最大压力下使用柱子（详见表3）。
表 1柱型 适用流速 (ml/min) 建议流速 (ml/min)PLgel 7.5mm ID PLgel MiniMIX 4.6mm ID PLgel Prep 25mm ID 0.5 – 1.50.2 – 0.55.0 – 20.01.00.310.0样品制备及进样根据样品的分子量来优化样品浓度毫无疑问是最好的方式。
宽分布样品通常可以比窄分布样品使用更大的浓度。
[讲解]葡聚糖凝胶柱的使用方法
![[讲解]葡聚糖凝胶柱的使用方法](https://img.taocdn.com/s3/m/bdc082eb900ef12d2af90242a8956bec0975a509.png)
葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。
(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
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凝胶色谱柱操作
凝胶色谱柱操作
1、溶胀
商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。
凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。
凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。
热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。
2、装柱
由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。
凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。
将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。
柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。
最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查
凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。
也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离
范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样
凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。
为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。
当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。
用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。
重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。
随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。
整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。
5、冲洗
凝胶色谱的流动相一半多采用水或缓冲溶液，少数采用水与一些极性有机溶剂的混合溶液，除此之外，还有个别比较特殊的流动相系统，这要根据溶液分子的性质来决定。
加完样品后，可将色谱床与洗脱液贮瓶及收集器相连，设置好一个适宜的流速，就可以定量地分布收集洗脱液。
然后根据溶质分子的性质选择光学、化学或生物学的方法进行定性和定量测定。
6、再生
因为在凝胶色谱中凝胶与溶质分子之间原则上不会发生任何作用，因此在一次
分离后用流动相稍加平衡就可以进行下一次的色谱操作。
但在实际应用中常有一定的污染物污染凝胶。
对已沉积于凝胶床表面的不溶物可把表层凝胶曲调，在适当增补一些新的溶涨胶，并进行重新平衡处理；如果整个柱有微量污染，0.5mo/LlNaCl溶液洗脱。
在通常情况下，一根凝胶柱可使用半年之久。
凝胶柱若经多次使用后，其色泽改变，流速降低，表面有污渍等就要对凝胶进行再生处理。
凝胶的再生是指用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质。
交联葡萄糖凝胶厂用温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠和混合液浸泡，用水冲洗到中性；而对于聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶由于遇酸碱不稳定，则常用盐溶液浸泡，然后用水冲到中性。
7、保存
经常使用的凝胶以湿态保存为主，为了避免凝胶床染菌，可加少许氯仿、苯酚或硝基苯等化学物质，它可以使色谱柱放置几个月至一年。
凝胶的干燥应先对凝胶进行浮选，除去细小的颗粒，并用大量水洗，除去盐和污染物，然后逐步增加一春浓度使凝胶收缩，在60~80度干燥，在整个操作过程中的蒸馏水、器皿和房间必须干净。
琼脂糖凝胶的干燥操作比较麻烦，并且干燥后还不容易溶张，所以一般仍以湿态保存为主。
凝胶色谱柱的使用方法
看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参考。
葡聚糖凝胶柱的使用方法大体有一下步骤：
(1) 预处理称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。
(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。
(1d为0.05ml，所以要1S两滴）胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。
直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装。
(3) 加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。
再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。
可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。
多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。
凝胶色谱的共性是流速慢，
每份一般体积较小。
（内径1.3cm左右，长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml）(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱多次使用后，若污染严重，则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后，再用水洗净即可。