TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定
稳定表达猪δ_冠状病毒S1_蛋白CHO_细胞系的构建与鉴定
河南农业科学，2023，52（6）：131‐138Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi ：10.15933/ki.1004‐3268.2023.06.014稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO 细胞系的构建与鉴定孙雪珂1，2，丁培阳3，王思桥1，2，刘思源2，李明慧2，常泽杰2，陈艺兰2，李瑞琪2，张改平1，2，4（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001；4.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）摘要：为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV ）S1蛋白的CHO 细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S 1转染至CHO 细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。
利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA 方法检测重组S1蛋白活性。
将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c 小鼠，通过间接ELISA 、间接免疫荧光试验（IFA ）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。
结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5mg/L 的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV 阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。
综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。
关键词：猪δ冠状病毒；S1蛋白；CHO 细胞；稳定表达；蛋白质纯化中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）06-0131-08收稿日期：2023-01-14基金项目：河南省重大科技专项（221100110600）作者简介：孙雪珂（1997-），女，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：动物免疫学。
稳定表达Tax基因HTLV-1细胞系的建立
成 人 Ｔ细 胞 白血 病 （ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ Ｔ － ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｅ ｕ ｋ ｅ ｍ ｉ ａ ， Ａ Ｔ Ｌ ） 是严 重危 害人 类健 康 的一 种疾 病 ， 是 由人 类 Ｔ 细 胞 白血 病 Ｉ型 病 毒 （ ｈ ｕ ｍａ ｎ Ｔ － ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｅ ｕ ｋ ｅ ｍ ｉ ａ ｖ ｉ ｒ ｅ ｓ ｔ ｙ ｐ ｅ ． １ ， Ｈ Ｔ Ｌ Ｖ ． １ ） 感染 所 致 的一 种 特殊 类 型 白血 病 ， 均 见 于成人 起病 。尽 管 目前 采 用 多 种 治 疗方 法 ， 但 对 于急性 或 淋 巴瘤 型 Ａ Ｔ Ｌ的预 后 还 是 很 差 。该 研 究应 用脂 质体 介导 法 将含 有 ｎ ｅ ｏ基 因的 Ｐ Ｃ ＭＶ—
河 南 职 工 医学 院 学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈｅ ｎ ａ ｎ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｆ ｏ ｒ Ｓ ｔ ａ ｆ ａ ｎ ｄ Ｗｏ ｒ ｋ ｅ ｒ ｓ ・１ ２１ ・
稳定 表 达 Ｔ ａ ｘ基 因 ＨＴ Ｌ Ｖ－ １细 胞 系 的 建 立
２ ０ ２ ｂ ｐ。
Ｔ ａ ｘ 载 体质 粒和 Ｐ Ｃ Ｍ Ｖ空 载 体质 粒分 别转 染 Ｔ淋 巴
瘤 Ｊ ｕ ｒ ｋ ａ ｔ 细 胞 系 ，利用 Ｇ ４ １ ８的药 物 选 择 特 性 对 转 染 细胞 进 行 压 力 筛 选 获 得 稳 定 表 达 外 源 基 因 的 细 胞， 并 对其 进行 鉴定 。模 拟 成 人 Ｔ淋 巴 细胞 白血 病
以 上 引 物 由 上 海 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司
合成。
２ 实 验 方 法
细胞 ， 从而 为 进 行 下 一 步 的相 关 研 究 奠 定 了基 础 。 也 为 临床揭 示 肿瘤 进 展 提 供重 要 的标 志 ， 有 利 于 肿
tef启动子原理
tef启动子原理TEF启动子原理什么是TEF启动子？TEF（Ternary Ethylenimine Functionalization）启动子是一种在生物科学中常用的DNA序列，用于操控基因的转录和表达。
它是一段特定的DNA区域，位于基因的上游区域，负责调控基因的启动。
本文将从浅入深来解释TEF启动子的原理。
TEF启动子的功能1.转录因子结合位点: TEF启动子包含多个转录因子结合位点（TFBS），使得转录因子能够与DNA序列结合，促进基因的转录。
2.启动子结构: TEF启动子包含TATA盒和启动子结构元件，有助于RNA聚合酶定位在正确的起始点，启动基因转录。
转录因子结合位点TEF启动子中的转录因子结合位点起到非常重要的作用。
转录因子是一类能够结合在DNA上的蛋白质，它们在基因的表达调控中发挥关键作用。
TEF启动子中的转录因子结合位点具有以下特征：•保守性：TEF启动子中的转录因子结合位点在不同个体和物种中具有高度的保守性，这意味着这些位点在进化过程中经过了选择，对基因的调控起到重要作用。
•序列特异性：不同的转录因子与不同的DNA序列结合，因此TEF 启动子中的转录因子结合位点具有特异的序列。
•协同作用：多个转录因子结合位点可以相互作用，形成转录因子复合物，共同调控基因的转录。
启动子结构TEF启动子的结构非常精密，包含了多个重要的结构元件：TATA盒TATA盒是TEF启动子中的一个重要结构元件，位于基因的上游区域。
TATA盒的主要作用是吸引RNA聚合酶，使其定位在基因的起始点。
TATA盒通常具有以下特点： - 富含腺嘌呤和胸腺嘧啶：TATA盒的序列富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T），这种序列特点使得TATA盒在基因组中相对较容易被识别。
- 保守性：TATA盒在不同基因中具有一定的保守性，这是因为TATA盒的序列特点对基因的正常转录非常重要。
启动子结构元件除了TATA盒之外，TEF启动子还包含了其他一些重要的结构元件，用于进一步精确地调控基因的转录。
大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定
大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定郑凯;谭建明;吴卫真;杨顺良【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)018【摘要】背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.【总页数】4页(P3331-3334)【作者】郑凯;谭建明;吴卫真;杨顺良【作者单位】解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心,福建省福州市350025;解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心,福建省福州市350025;解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心,福建省福州市350025;解放军南京军区福州总医院全军器官移植中心,福建省福州市350025【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.靶向大鼠TGF-β1基因shRN A真核表达载体的构建及鉴定 [J], 都泓莲;张千;邓存良2.大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定 [J], 严会文;苏敏;高杰;廖文萍;闫丽丽;黄悦3.大鼠STAT3基因靶向shRNA真核表达载体的构建及鉴定 [J], 张五星;周伟;赵学伟;丁晓然;周喆;张智敏;周焕芝;石炳毅4.大鼠PDGF-C基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 楚元奎;杨丽;廖国玲;杨华;于欣;刘学英5.靶向大鼠gnas基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定 [J], 田运娇;易岂建;米青;李娅莎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
稳定表达人Fhit突变体细胞系的建立
稳定表达人Fhit突变体细胞系的建立于芳;绳纪坡;胡宝成【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2012(023)002【摘要】Objective: To construct the eukaiyotic expression vectors of human fragile histidine triad (Fhit) mutation genes and to establish stable expressed cell lines of human Fhit mutants in order to confirm Fhit and replication protein A(RPA) interaction in mammalian cells. Methods: Three Fhil mutant cDNA were inserted into the eukaiyotic expression vector pREPIO containing HA-tag, HeLa cells were transfected with pREP10/HA vector alone or the plasmids pREP10/FhitA/D/F-HA, stable cell lines were selected from hygromycin B resistant colonies and the expressed Fhit mutants were verified by Western blot with HA antibody. Results: The eukaryotic expression vector pREP10/FhitA/D/F-HA was verified by PCR and sequencing, human Fhit mutants were highly expressed in the transfected HeLa cells. Conclusion: Three stable cell lines HeLa-FhitA/D/F expressing Fhit mutant were established, it is the basis to study the role of the interaction between Fhit and RPA in DNA damage response.%目的:构建人脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体真核表达载体并建立稳定表达人Fhit突变体的细胞株,以便进一步研究Fhit与复制蛋白A(RPA)在体内的相互作用.方法:将3种人Fhit突变体cDNA克隆至带有HA标签的真核表达载体pREP10上,构建人Fhit突变体真核表达载体,转染HeLa细胞,经湖霉素B加压筛选阳性克隆,用Western印迹鉴定稳定表达Fhit突变体蛋白FhitA、FhitD和FhitF的阳性细胞株.结果:经PCR鉴定及序列分析,Fhit突变体基因真核表达载体pREP10/FhitA/D/F-HA构建正确,转染人HeLa细胞,筛选出Fhit突变体表达较高的细胞株.结论:建立了3株稳定表达Fhit突变体的细胞株HeLa-FhitA/D/F,为研究Fhit与RPA的相互作用在DNA损伤应答中发挥的作用奠定了基础.【总页数】3页(P183-185)【作者】于芳;绳纪坡;胡宝成【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q75【相关文献】1.稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立 [J], 孙静;魏永伟;章晓栋;于涟2.HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立 [J], 杨阳;黄娜;高岭;常素娥;郭波;胡丽丽;宋土生;黄辰3.截断型突变体HBx-Mut120稳定表达真核细胞系的建立 [J], 鲍艳婷;陈公英;王洁;李鸽;葛柯4.CD151及其突变体在人脐静脉内皮细胞系中的稳定表达 [J], 李鹏程;王赟;左后娟;邹远林;刘正湘5.细胞色素P4502 A13野生型/突变体稳定表达Flp-InTM CHO细胞系的建立 [J], 郑丹丹;李靖;王永林;李勇军;刘亭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
真核转染稳定筛选标记及原理
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
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小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞系的构建
稳定表达荧光素酶基因的TC-1细胞系的构建韩笑笑;刘丽雅;谭超月;李元;高君碧;韩丽萍【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(053)004【摘要】目的:通过表达荧光素酶的慢病毒载体感染TC-1细胞株,建立稳定表达荧光素酶的TC-1细胞株.方法:根据荧光素酶基因设计引物,PCR扩增获得目的基因,构建表达荧光素酶的慢病毒载体并包装重组慢病毒,感染TC-1细胞.嘌呤霉素加压筛选,鉴定.用双荧光素酶报告基因检测试剂盒及体外成像系统进行荧光素酶活性检测.结果:经检测证实细胞感染及筛选后,成功构建了稳定高表达荧光素酶的TC-1细胞.结论:获得荧光素酶稳定表达的TC-1细胞,转染效果确切,荧光素酶基因表达稳定.【总页数】4页(P429-432)【作者】韩笑笑;刘丽雅;谭超月;李元;高君碧;韩丽萍【作者单位】郑州大学第一附属医院妇科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室郑州450052【正文语种】中文【中图分类】R711.74【相关文献】1.稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究[J], 唐颖;胡小童;朱炳林;韩宇2.建立稳定表达T-抗原、核转录因子-κB的DNA结合域和荧光素酶基因的人脐静脉内皮细胞系 [J], 刘艳霞;CaoWangsen;IraniKaikobad;李学军3.表达荧光素酶报告基因稳定细胞系的建立及对CBLB502活性的检测 [J], 汤立宣;王治东;许望翔;葛常辉;杨晓明4.稳定表达荧光素酶BGC823细胞系的构建 [J], 王琳;张紫怡;金静;段海潇;王润杨;胡翰;汪洋;刘滨磊5.慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证[J], 覃鸿妮;谢钰珍;杨晨晨;张勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定
稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定张一折;王鹏;张守涛;刘伟;刘国祥【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(044)001【摘要】目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB 方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.【总页数】4页(P145-148)【作者】张一折;王鹏;张守涛;刘伟;刘国祥【作者单位】郑州大学生物工程系,郑州,450001;吉林省四平市疾病预防控制中心,四平,136000;郑州大学生物工程系,郑州,450001;郑州大学生物工程系,郑州,450001;郑州大学生物工程系,郑州,450001【正文语种】中文【中图分类】R183【相关文献】1.HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达 [J], 李德良;马文丽;师永霞;李凌;张宝;郑文岭2.HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定 [J], 李德良;马文丽;师永霞;李凌;郑文岭3.利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立 [J], 王燕;王宇暄;刘亚敏;张桂强;苏文洲;郭奇峰4.新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定* [J], 王瑞;邓洪新;王国庆;严飞;彭枫5.HIV-1 ADA株gp140真核表达载体的构建与鉴定 [J], 李玉雪;王甲业;李庆海;李妍;凌虹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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TEF-1δ基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定
佚名
【期刊名称】《癌变·畸变·突变》
【年(卷),期】2002(014)003
【摘要】目的: 构建TEF-1δ (mouse translation elongation factor-1δ) 的稳定表达系统.方法: 采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法,以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体,构建了TEF-1δ转基因CHO和COS7细胞系,Western Blot分析与鉴定表达蛋白.结果: 在10株转染和经G418反复筛选的CHO细胞系中,有3株(编码为COH-pcDNA3.1-TEF-1δ#3,#6,#14)具有高效稳定表达的TEF-1δ编码蛋白质(Mr约31×103),其余CHO细胞株的TEF-1δ蛋白质表达相对较弱或无表达.在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞系中,4株细胞(编码为COS7-pcCDNA3.1-TEF-1δ #4,#8,#14和#17)均有高效稳定的TEF-1δ编码蛋白表达,相应的无转染组及载体对照组的CHO和COS7细胞均无TEF-1δ蛋白质表达.结论: 这两类TEF-1δ转基因哺乳动物细胞稳定表达系统已成功构建与鉴定,该表达系统的建立对于TEF-1δ这一新基因的生物学功能研究,尤其是镉的致癌作用与致癌机制的研究有重要应用价值.
【总页数】4页(P171-174)
【正文语种】中文
【中图分类】R730.2
【相关文献】
1.F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定 [J], 曹晓敏;庞战军;全松;邢福祺
2.β-NGF在真核细胞蛋白表达系统中的表达及活性鉴定 [J], 李贤慧;王桂云;王育强;郭新民
3.糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定 [J], 蒋琳;季旻珺;吴海玮;贾悦;唐伟;刘翠萍;张兆松;刘超
4.原核表达系统T7 RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究[J], 袁志刚;张进平;储以微;王缨;徐薇;熊思东
5.利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立 [J], 王燕;王宇暄;刘亚敏;张桂强;苏文洲;郭奇峰
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