激光共聚焦显微镜
激光共聚焦原理范文
激光共聚焦原理范文激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种应用激光光源和共聚焦光路原理的现代显微镜，其基本原理是利用激光光源产生的激光束，通过聚焦物镜将激光束聚焦到样品上，并收集样品反射、透射或荧光发射的激光信号，经过共聚焦光路的滤波和光电倍增器放大后，通过扫描装置控制光束在样品不同位置的扫描，最后通过成像系统将信号转化为图像。
下面详细介绍激光共聚焦显微镜的原理。
1.光路结构激光共聚焦显微镜的光路结构主要由激光器、激光光束系统、共聚焦光学系统和光学检测系统组成。
激光器通常采用氩离子激光器或氮气激光器等可产生高能量、窄谱宽激光束的光源。
激光光束系统由准直器、束整形器和聚焦器组成，主要用于产生、整形和准直激光光束。
共聚焦光学系统由物镜和扫描装置组成，其主要作用是将激光光束聚焦到样品上，并进行扫描。
光学检测系统主要由物镜、分光器、光学滤光器和光电倍增器等组成，用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
2.激光共聚焦光学系统原理激光共聚焦光学系统由聚焦镜头和扫描装置组成。
聚焦镜头由物镜和扫描镜组成，物镜用于将激光光束聚焦到样品的局部区域，扫描镜用于控制激光光束在样品上的扫描。
聚焦镜头的光学轴与激光光束保持一致，其焦点与样品接触面构成一个共聚焦点，也称为焦斑。
激光光束通过聚焦镜头后，其径向和轴向分辨率都很高，使得显微镜在透射成像的同时，还能够进行光学切片和三维重建。
扫描装置通过控制扫描镜的运动，使激光光束可以在样品平面上进行扫描，从而实现对样品不同位置进行扫描成像。
3.光学检测系统原理光学检测系统主要用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
光学信号经过物镜和分光器后进入光学滤光器，滤光器可以选择性地透过或屏蔽特定波长的激光信号。
经过滤光器的激光信号最后进入光电倍增器，通过电子放大器将光信号转化为电信号，再通过数模转换器转化为数字信号，最终通过计算机处理并生成图像。
尼康激光共聚焦参数
尼康激光共聚焦参数激光共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，广泛应用于生物医学研究、细胞生物学、神经科学等领域。
尼康作为一家知名的光学设备厂商，也推出了多款激光共聚焦显微镜产品。
在讨论尼康激光共聚焦显微镜的参数时，我们可以从以下几个方面进行描述：1.光源和激光器参数：尼康激光共聚焦显微镜通常采用一种或多种激光器作为光源。
常见的激光器类型包括氦氖激光器（HeNelaser）、氩离子激光器（Arlaser）、固体激光器（例如：二极体激光器、可调谐激光器等）。
激光器的波长通常在可见光范围内，如绿色激光器（波长为488nm）。
2.目标镜参数：尼康激光共聚焦显微镜的目标镜通常有不同的倍数和数值孔径可供选择。
倍数越高，显微镜的放大倍率就越大，细节分辨率也相应提高。
而数值孔径越大，镜头的进光能力越强，成像质量也相应提高。
3.探测器参数：尼康激光共聚焦显微镜通常配备高灵敏度的光电倍增管（PMT）作为探测器，可实现精准的光信号接收和转换。
PMT 的灵敏度与噪声水平、动态范围等参数密切相关，而这些参数的优劣将直接影响到显微镜成像的质量。
4.扫描镜和扫描模式参数：尼康激光共聚焦显微镜通常采用两块共同工作的扫描镜（通常是X和Y轴方向），通过电压信号控制其扫描速度和方向。
此外，扫描镜的行程范围和重复性也是显微镜参数中需要关注的，它们决定了扫描范围的大小和成像的稳定性。
5.附件和功能模块参数：尼康激光共聚焦显微镜通常有多种可选的附件和功能模块，以满足不同用户的需求。
例如，通过添加活细胞培养箱，可以在显微观察中为细胞提供一个恒温、恒湿的环境；通过添加荧光恢复后蛋白质动力学（FRAP）功能模块，可以实现实时观察分子在细胞内的动态行为。
以上参数描述仅就尼康激光共聚焦显微镜的一般情况进行了简要介绍，具体产品型号和配置不同，参数可能会有所差异。
在选择适合自己的激光共聚焦显微镜时，可以根据实际需求和研究领域选择合适的参数配置。
激光共聚焦显微镜注意事项
激光共聚焦显微镜注意事项《激光共聚焦显微镜：那些你不可不知的注意事项朋友们，今天咱就来唠唠激光共聚焦显微镜这个“神奇”的玩意儿，不过在使用它的时候，那可真是有不少需要注意的事儿呢，且听我一一道来。
首先，这仪器就像是个娇贵的大小姐。
每次使用前，你得像伺候大小姐起床一样，精心准备。
那环境温度和湿度得在合适的范围，温度要是太高了或者太低了，这显微镜就像大小姐耍小脾气似的，可能就不那么好使了。
湿度也是，稍不注意就可能让仪器受潮，那就麻烦了。
我有一次就因为疏忽了湿度，结果图像上总有一些奇怪的噪点，费了好大劲排查才发现是这个问题。
在操作过程中，样品的制备简直是关键中的关键。
这就好比给大小姐打扮，如果打扮不好，她可不会美给你看。
样品要是太厚了，激光就像个疲惫的工人，根本穿不透啊，你就没法得到理想的图像。
而且，荧光标记的时候必须准确无误，就像给大小姐涂口红，涂歪了可不行。
有一次我少加了一种荧光染料，结果想要看的两个信号硬是少了一个在图像里，感觉就像准备了一场接力赛，结果发现少了一个运动员。
再说到聚焦的问题。
你得小心翼翼地转动旋钮，就像走钢丝一样，稍微一转多了，美好的图像就“失焦”了，那画面一下子就成了模糊的“印象派”画作，看起来一团糟。
这时候心里那个郁闷啊，就像精心准备的演出结果一下子乱了套。
还有，对激光功率也要谨慎对待。
这激光功率像是大小姐的饭量，给多了不行，给少了也不行。
功率太高，样品会被烤焦的啊，就像头发用了太多高温直板夹，变得脆脆的。
功率太低呢，荧光信号又弱得可怜，像是星星点点散在夜空中微弱的光一样，根本看不清全貌。
当使用完之后，这仪器的清洁和复位可不能偷懒。
你要把它恢复如初，就像是送大小姐回闺房休息一样，各种部件要归位，该清洁的地方要清洁干净。
要是觉得用完就万事大吉，下次使用的时候，可能就会遭遇各种莫名奇妙的问题。
激光共聚焦显微镜虽然是一个超级强大的工具，但使用起来就像和一个挑剔的伙伴合作一样。
你必须细心周到，遵守这些注意事项，才能让它乖乖听话，为你展现出微观世界的精彩画卷。
荧光共聚焦和激光共聚焦
荧光共聚焦和激光共聚焦荧光共聚焦显微镜（Fluorescence Confocal Microscopy，FCM）和激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）是两种常见的高分辨率显微镜技术。
它们能够提供具有亚细胞级别分辨率的三维图像，并广泛应用于生物医学研究、细胞生物学、神经科学等领域。
本文将逐步回答有关这两种技术的问题。
一、什么是荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜？荧光共聚焦显微镜和激光共聚焦显微镜是两种基于共焦原理的高分辨率显微镜技术。
共焦显微镜利用聚焦光束与样品相交的特点，通过收集样品反射或荧光产生的信号来获取图像，并排除来自样品深部的散射或荧光信号，从而提高图像的清晰度和分辨率。
二、荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜有何区别？荧光共聚焦显微镜和激光共聚焦显微镜在技术原理上是相似的，它们都是通过聚焦光束与样品相交，同时收集样品的信号来获取图像。
然而，它们在光源、探测器和成像模式等方面存在细微差别。
1. 光源：荧光共聚焦显微镜通常使用白光波长或相对宽的光源，如汞弧灯、钨丝灯或LED照明来激发样品中的荧光标记物。
而激光共聚焦显微镜则使用激光器作为光源，能够提供单一波长、高纯度的激光光束。
2. 探测器：荧光共聚焦显微镜的探测器通常是光电管，它能够检测荧光信号的强度和位置。
而激光共聚焦显微镜则使用光电倍增管（PMT）或光电二极管（APD）等高灵敏度探测器，能够实时探测并记录荧光信号。
3. 成像模式：荧光共聚焦显微镜主要采用点扫描模式，即通过聚焦光束在样品上的局部区域进行扫描，获取逐点的荧光强度。
而激光共聚焦显微镜则采用线扫描模式，通过聚焦光束在样品上的线条进行扫描，获取逐线的荧光信号。
三、荧光共聚焦和激光共聚焦显微镜的工作原理是什么？1. 荧光共聚焦显微镜的工作原理：荧光共聚焦显微镜与传统荧光显微镜相似，先用荧光染料或荧光标记的抗体对样品进行标记，然后使用荧光光源激发样品中的荧光标记物。
激光共聚焦荧光通道
激光共聚焦荧光通道
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光光源来聚焦样品表面的特定区域，通过采集经过激光激发的荧光信号来获取高质量的细胞或组织的三维图像。
在激光共聚焦显微镜中，荧光通道是指用于检测和记录样品中荧光信号的特定光学通道。
激光共聚焦显微镜通常配备多个荧光通道，每个通道可以选择特定的荧光染料来激发和检测。
通过选择不同的荧光通道，可以同时观察多种荧光标记物，或者对同一标记物的不同特性进行观察，从而获取更加丰富的信息。
这些荧光通道通常与特定的激光波长和荧光滤光片相对应，以确保精确的激发和检测荧光信号。
在实际的显微镜操作中，研究人员可以根据实验需求选择合适的荧光通道组合，以获得最佳的荧光成像效果。
不同的荧光通道可以用于观察不同的细胞器、蛋白质或其他生物分子的位置和分布，从而帮助研究人员理解细胞结构和功能。
同时，荧光通道的选择也需要考虑到荧光染料的光谱特性和相互干扰的情况，以避免信号重叠和混淆。
总之，激光共聚焦显微镜中的荧光通道是非常重要的，它们为研究人员提供了丰富的荧光成像选择，帮助揭示生物样品内部结构和功能的细节。
通过合理选择和使用荧光通道，研究人员可以获得高质量的荧光成像数据，为生物学研究和医学诊断提供重要的支持和帮助。
激光共聚焦操作步骤
激光共聚焦操作步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM），是一种光学显微镜，利用激光和扫描镜技术，能够对样品进行高分辨、高对比度的三维成像。
下面将介绍激光共聚焦显微镜的操作步骤。
1.准备工作：a.打开显微镜电源，确保仪器处于正常工作状态。
b.打开激光源电源，等待激光系统启动。
c.准备样品，将样品放置在载玻片上，并使用封口膜或密封胶固定。
2.调节孔径光阑：a.打开镜头盖，取下玻璃保护盖。
b.观察显微镜视野，调节孔径光阑的大小，以获得最佳的入射光。
c.用合适的滤光片选择适当激光激发波长。
3.调节激光功率：a.打开激光源的控制面板。
b.选择合适的激光功率，通常初次使用时可选择较低功率。
c.通过目镜观察激光处于合适的位置和方向，避免直接观察激光。
4.调节焦距：a.打开目镜盖，观察样品上的图像。
b.调节目镜的焦距，获得清晰的图像。
c.使用恰当的倍率进行观察，确保所需的细节可见。
5.调节光路：a.打开激光共聚焦显微镜软件，进行光路调节。
b.调节反射镜和聚焦镜，确保激光能够准确地聚焦在样品上。
c.通过调节扫描镜，使激光能够扫描整个样品。
6.设置扫描参数：a.在软件中选择扫描参数，如扫描速度、像素大小等。
b.减至最小的扫描区域，以便首先观察最感兴趣的区域。
c.如有需要，可以进行连续扫描或者多通道扫描的设置。
7.开始扫描：a.点击软件界面上的“开始”按钮，开始扫描。
b.观察扫描时光点在样品上的移动情况，确保图像的获取和处理是正确的。
c.根据需要调整扫描参数，以获得更好的图像质量。
8.界定感兴趣区域（ROI）：a.选择感兴趣的图像区域，用鼠标进行界定。
b.设置参数，如增益、对比度、亮度等，以便获得更好的视觉效果。
c.按下截图按钮，将感兴趣的图像保存下来。
9.分析和处理图像：a.关闭扫描功能，进入图像处理模式。
b.使用软件提供的功能分析和处理图像，如三维重建、图像拼接等。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
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胰腺细胞悬浮液样品适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。
胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。
显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。
Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。
荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。
方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。
F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。
用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的PluronicF-127备用。
2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10 umol/L染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光温育30 min。
3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。
4.启动LSCM，选择488 nm 氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫描次数（300次），开始扫描。
5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。
1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了.2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。
我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。
1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。
你最好拿弱酸，如稀盐酸浸泡。
2、然后灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片。
3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了。
一定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了。
4、在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油或其它胶固定。
用锡箔纸报住，避光4c保存，最多一个月。
5、最好染核，核好染，同时也便于观测。
6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦。
毕竟激光共聚焦很贵。
我做过confocal，我个人觉得用confocal来看细胞的亚结构非常好。
我用的OLYMPUS的FV1000,我看过说明书介绍，confocal可以做离子浓度的测定，但是我没有做过。
组织的切片一样可以做confocal,我的一个朋友就是做的组织，方法和做细胞的荧光一样，结果不错。
我当时做的是细胞的免疫荧光，方法和基本的免疫荧光一样，细胞种在载玻片上，60%融合就好，不要长满，因为细胞太多，挤在一起的话，会影响成像。
一抗，荧光二抗，依次孵育。
我把我毕业论文中的一张图贴上来给大家看看。
我做的是双染，一个抗体用的FITC（绿色），是一种微管蛋白；另一个用的是TRITC，是一种结构蛋白。
黄色是两种融合的图像，结果发现这两种蛋白结构上共地位。
是否要confocal和免疫组化都做要取决于实验的具体检测指标和实验的目的，比如检测核因子等转录因子，静息状态时核因子kb 存在于细胞浆，刺激时进入细胞核，这样用激光共聚焦的共定位技术就可以很清楚的指示出来，而免疫组化只能粗略的看出。
组织切片的自发荧光应该是限制了荧光标记技术在这一方面的应用，所以不做任何处理，在荧光显微镜下都可以看到荧光，处理这样的情况一是选用不同的标记荧光尽量避开自发荧光，也有些去除自发荧光的措施，要具体情况具体使用了。
当然不排除有些文章纯粹为了confocal而confocal，其实能用简单的实验说明问题了就不要选用复杂的了，免疫组化的定位显示在发国外论文的时候还是很受重视的。
免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………（一）直接方法……………………………………………………………………………1．检查抗原方法……………………………………………………………………2．检查抗体方法……………………………………………………………………（二）间接方法……………………………………………………………………………1．检查抗体(夹心法)方法……………………………………………………………2．检查抗体方法……………………………………………………………………3．检查抗原法………………………………………………………………………（三）补体法………………………………………………………………………………1．直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………2．间接检查组织内抗原方法………………………………………………………（四）双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………（五）对照试验……………………………………………………………………………1．直接方法…………………………………………………………………………2．间接方法…………………………………………………………………………3．补体方法…………………………………………………………………………三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………（一）荧光素………………………………………………………………………………1．异硫氰酸荧光素…………………………………………………………………2．四甲基异硫氰酸罗达明…………………………………………………………3．得克萨斯红(Texas red)……………………………………………………………4．其它荧光素…………………………………………………………………………（二）荧光素标记抗体的方法……………………………………………………………1．FITC标记抗体的方法……………………………………………………………2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法……………………………………………3．藻红蛋白标记抗体方法……………………………………………………………4．蓝色荧光素标记抗体方法…………………………………………………………（三）荧光抗体的质量控制………………………………………………………………1．染色特异性和敏感性的测定方法…………………………………………………2．F/P比值的测定方法………………………………………………………………3．荧光抗体的保存……………………………………………………………………四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………（一）荧光抗体染色方法…………………………………………………………………1．直接方法……………………………………………………………………………2．间接方法(双层法) ………………………………………………………………3．间接方法(夹心法) ………………………………………………………………4．补体方法……………………………………………………………………………5．膜抗原荧光抗体染色方法………………………………………………………6．双重染色方法………………………………………………………………………7．荧光抗体再染色方法………………………………………………………………（二）荧光抗原染色方法…………………………………………………………………五、荧光显微镜检查方法………………………………………………………………………（一）荧光和荧光显微镜…………………………………………………………………（二）荧光显微镜标本制作要求…………………………………………………………1．载玻片……………………………………………………………………………2．盖玻片……………………………………………………………………………3．标本…………………………………………………………………………………4．封裱剂………………………………………………………………………………5．镜油…………………………………………………………………………………（三）使用荧光显微镜注意事项…………………………………………………………（四）荧光图像的记录方法………………………………………………………………六、非特异性染色的消除方法…………………………………………………………………（一）非特异性染色的主要因素…………………………………………………………（二）消除非特异性染色的方法…………………………………………………………1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法………………………………………………………2．DEAE纤维素柱层析法……………………………………………………………3．荧光抗体稀释法…………………………………………………………………4．纯化抗原方法………………………………………………………………………5．纯化抗体方法——免疫吸收方法………………………………………………6．伊文氏蓝(Evans blue)衬染色方法………………………………………………七、现状与展望…………………………………………………………………………………一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。
它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter (FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。