沈的x染色质制备及观察
实验四 X染色质、人类染色体G显带标本的制备及观察(“染色”相关文档)共10张
一、实验目的
学习X染色质的标本制作。 观察X染色质、形态特点。 了解人类染色体G显带技术方法
二、实验原理
在间期，女性体细胞中两条X染色体中的一条异染色质
化。用Giemsa染色法可使其着色，本方法的优点是只有
Giemsa染液中染色约5min。
染02色%：胰G蛋ie白m酶细sa溶染液胞液中（，p核H并7不.清断摆晰动，着2. 色，胞浆不着色，因此细胞核背景清晰， 利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。 4 磷酸缓冲液 5ml + Giemsa原液 11滴（毛细滴管）染色8～10min，流水冲洗。
G显带区的DNA有较丰富的A-T对，有相当一部分中度重复序列DNA 可能在G带区，Giemsa染料在G带区的结合与其相应的DNA 和非组 蛋白有关。
三、实验方法与步骤
1, 制备： G-带胰酶消化法
胰酶温度➢和处外理时周间血需控培制好养，一常般胰规酶法处理制时间作不少染于色30S体标本，置60℃烘箱烘8h～10h，或
➢ 玻片晾干后置入固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)中10min。 ➢ 晾干，置入5mol/L HCl中，室温下水解20min。 ➢ 在新鲜的蒸馏水中涮洗四次，以充分去HCl，以免影响染色液的
pH。 ➢ Giemsa染液中染色约5min。
➢ 先后用蒸馏水冲洗，晾干。
观察
四、实验结果
（毛细滴管）染色8～10min，流水冲洗。
02% 胰蛋白酶溶液入染色缸，加入0.
空气干燥、镜检。 预处理的方法非常多，可用热、碱、各种蛋白酶、尿素等，其中最常用的是胰蛋白酶进行预处理。
➢ 玻片晾干后置入固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)中10min。
在间期，女性体细胞中两条X染色体中的一条异染色质化。 在新鲜的蒸馏水中涮洗四次，以充分去HCl，以免影响染色液的pH。 时间越长，细胞对胰酶处理的抵抗性越强，片龄过长的标本染色后会导致斑点状而非带纹。 实验四 X染色质、人类染色体G显带标本的制备及观察 了解人类染色体G显带技术方法 胰酶温度和处理时间需控制好，一般胰酶处理时间不少于30S 时间越长，细胞对胰酶处理的抵抗性越强，片龄过长的标本染色后会导致斑点状而非带纹。 首先取决于染色体本身的质量，染色体要较长，以早中期为宜，且中期相丰富、分散好，无胞浆背景。 学习X染色质的标本制作。 将烤三天的玻片从37℃烘箱取出，投入0. 外周血培养常规法制作染色体标本，置60℃烘箱烘8h～10h，或80℃烘3h，然后置37℃烘箱烘3d 左右即可予处理。 观察X染色质、形态特点。
染色体标本的制备及组型观察 实验报告
细胞生物学实验报告染色体标本的制备及组型观察1.实验目的：掌握染色体标本制作的基本方法；认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯（1）实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素（2）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）制作染色体标本的意义：了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。
染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。
（2）染色体组型图的应用①鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64条②遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。
（3）染色体标本的制作①观察：由于分裂期中期的染色体染色体凝集程度最高，因而我们应尽量使细胞停留在分裂期中期以便观察。
②细胞：为尽量看到多的染色体，我们应当选取具有旺盛分裂能力的细胞，这样的细胞可以来自:胸腺、骨髓、睾丸、小肠等。
我们在此实验中使用的是小鼠的精巢细胞。
在做人的染色体标本时，我们使用的是血液里的淋巴细胞。
③药物：PHA（植物细胞凝集素）：PHA具有促进细胞凝集和分裂的作用。
PHA可以使血液中的淋巴细胞还原至淋巴母细胞（只存在于骨髓中）秋水仙素：秋水仙素可以破坏微管的组装，纺锤体不能形成，细胞分裂停在中期。
与秋水仙素作用相同的药物还有长春花碱、鬼臼素、苯环己烯等。
可以促进胃管组装的药物有紫杉酚、重水等。
④空气干燥：使细胞与染色体易于分离⑤低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体距离变大，易于分离、展平。
人类性染色质标本的制备和观察
实验一
X染色质
实验一
Lyon假说:
（1）正常女性体细胞内仅有1条X染色体有活性，另 一条X染色体在遗传上是失活的，在间期细胞 核中高度螺旋化而呈异固缩的X染色质。
（2）X染色体失活发生在胚胎早期。 （3）X染色体失活的随机性和恒定性。
实质：失活的X染色体 意义：X染色体的剂量补偿 X染色质的数目=X染色体数-1
1、几对基本概念 染色质——染色体 常染色质——异染色质 常染色体——性染色体
实验一
内容步骤
实验一
（一）性染色质的定义及形成机制
1、几对基本概念
性染色质（sex chromatin）：
在间期细胞核中性染色体的异染色质部分显示出 来的一种特殊结构，包括X染色质和Y染色质 。
内容步骤
（一）性染色质的定义及形成机制
隐性
紧貼脸颊 不能
无 拇指第一节向指背弯曲
较无名指短 无(单眼皮)
无 左手拇指在上
实验一
课后作业
1、绘制人类口腔黏膜上皮细胞（示X染色质） 2、自学理论书P114-115遗传平衡定律及遗传
平衡群体的判断，判定是否为平衡群体。
实验一
预习
实验二：人类染色体核型分析 （实验指导：P59；P62） 准备：非显带核型的照片染色体剪下
实验一
基因
tt Tt TT
实验一
（三）PTC尝味实验：
1、原理 人类味觉对苯硫脲（又称苯基硫代碳酰二胺，
PTC）的敏感性由一对等位基因（T、t）控制，属不 完全显性遗传。基因型不同的个体尝出含PTC溶液的 浓度有明显的差异。
6 7 10 11
①②③ ④
tt
预防医学
成。 典型的X染色质位于核膜内侧缘，大小为1~1.5um，形 状多为半圆形、三角形、不规则形。正常女性间期细 胞中X染色质的阳性率为10~30%，在男性间期细胞则 平均低于1%。从理论上讲，正常女性的间期细胞中都 应该有一个X染色质，但事实上由于染色方法、染色技 术以及X染色质在细胞核中的位置不同，实际检查中不 可能在每个细胞中都看到。 X染色质的本质是兼性异染色质。 在胚胎发育的3~4周，女性胚胎中两条X染色体中的一 条随机发生失活变为X染色质；而存在于女性卵子中的 X染色质在与精子受精时即会变回常染色质而恢复活性。
实验 X染色质标本制备与观察
目的要求
（1）掌握X染色质标本制备方法及其原理。
（2）掌握X染色质的形态特征及其临床意义。
实验原理
一个个体不论其细胞中有几条X染色体，
均只有一条具有转录活性，其余的X染色 体均失活形成异固缩的X染色质。正常女 性间期细胞核中X染色质阳性率一般约为 10％一30％，有的可高达50％以上。其出 现率的高低与个体不同生理状态、染色方 法、染色技术以及X染色体在细胞核中的 位置不同有关。在男性间期细胞核中则平 均低于1％。一般检查X染色质确定性别时， 观察200个细胞，X染色质出现5％以上者 为女性。现在，X染色质检查已广泛应用 于临床，作为性别测定和性染色体数目异 常的一种辅助诊断方法。
镜检：用油镜观察典型的“可计数细
胞”。 可计数细胞的标准： 1.核质呈网状或细颗粒状分布 2.核膜清晰，无缺损； 3.染色均匀； 4.周围无杂质。
观察与结果（理想）
高倍镜下可见许多染成红色的细胞核，
细胞质不着色或不明显。选择核较大， 染色清晰，轮廓完整，核质呈均匀细网 状的细胞进行观察。找到核膜内侧缘有 红色浓染小体的细胞核后，换油镜进一 步观察。油镜下X染色质为红色平凸形、 三角形、扁平形的浓染小体。
题目 X染色质小体标本制备与观察
题目 X染色质小体标本制备与观察【实验目的】1．了解X染色质的形成原理及X染色质的检查意义。
2．掌握X染色质标本的制备方法3．能正确鉴别X染色质【实验原理】①正常女性核型为46，XX。
在间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质小体，是不具有转录活性并呈异固缩状态的X染色质这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。
这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。
②失活的X染色质小体一般位于细胞核内边缘，直径一微米左右，形状多样，有微凸形、三角形、圆形、短棒形等③X染色质小体数=X染色体数-1，正常女性1个，细胞检出率>40%，男性<2%④人的性别是由X和Y染色体决定的。
需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外，还可以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内X染色质。
⑤正常女性间期细胞中，X染色质阳性检出率为20％～70％，大多为30％～50％，高时可达70％以上，男性细胞中则平均低于1％。
可采取口腔粘膜细胞，绒毛细胞，羊水细胞等进行检查【实验主要仪器试剂】1．试剂：45％乙酸，卡宝品红2．器材：显微镜，小吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，擦拭纸【实验材料】人体头发毛囊【实验方法步骤】1、快速拔取头发2、2、将含有毛囊的头发置于载玻片上（4或10倍镜检观察）3、3、滴上一滴45%乙酸水解至毛囊极易剥离（用解剖针轻刮即脱落为宜）4、分离毛囊，去除毛干和胶质，滴上一滴卡宝品红（刮毛囊前先将大部分乙酸去除后再轻刮下毛囊）5、染色10分钟后拇指压片法轻压或不压6、镜检（10倍镜找目标，40倍镜观察并拍照），计数7 、镜检l00个细胞，统计含有X染色质细胞所占的百分率。
正常值：男性： 2％以下或没有，女性：40％以上。
【实验结果及讨论】1：拔取头发时，要连根部拔起，小心放至载玻片上，以求拔下的头发含有毛囊且不易破坏可以观察。
实验九 人体X-染色质的观察
4.莱昂氏假说的修正（新莱昂氏假说）
（1）提出：1967年，美国的遗传学家Ohno 提出45，X≠46，XX；47XXY≠46，XY， 这两个不等式是否成立的疑问。
（2）按照莱昂假说应该是两者完全相同，但 45，X与47，XXY实际是两种综合症。
（3）修正：1974年，失活的X染色体上并非 全部基因都呈莱昂化失活。
2. 发根毛囊细胞的X染色质（Barr小体）显示方法
⑴取材：拔取女性带毛囊细胞的头发，置于载玻片上； ⑵固定：在毛囊上滴加一滴45%的醋酸（或5mol/L盐酸）
固定5min，吸掉多余的醋酸； ⑶染色：用镊子将软化的毛囊剥下，加一滴石炭酸品红
染色2~3min； ⑷制片：盖上盖片，垫上滤纸用拇指压片； ⑸镜检：低倍→高倍。
六、作业
1. 观察50个女性可数的细胞，并计算巴氏小 体细胞所占的百分比。
2. 绘制3个典型的显示X染色质的细胞。
药品： 60%醋酸 、45%的醋酸 、 石炭酸品红。
四、实验方法
1.口腔黏膜细胞X染色质（Barr小体）显示方法
⑴ 取材：漱口3~4次后，用无菌牙签从面颊部内侧刮取 口腔黏膜细胞，第一次的刮取物弃去，在原位重复刮 2~3下，涂在载玻片上； ⑵ 固定：加一滴60%醋酸固定5min，用滤纸吸去多余 醋酸； ⑶ 染色：加一滴石炭酸品红染色2min； ⑷ 制片：盖上盖片，垫上滤纸用拇指压片； ⑸ 镜检：低倍→高倍。
1961年 M.F.Lyon提出：
① 正常雌性哺乳动物体细胞中的两条 X染色体之一在遗传性状表达上是 失活的；
② 在同一个体的不同细胞中， X染色 体失活是随机而恒定的；
③ 失活现象发生在胚胎发育的早期。
人类X染色质(巴氏小体)制备与观察
人类X染色质（巴氏小体）的制备与观察摘要巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中形成的呈异固缩状态，贴近于核膜边缘的染色小体，在遗传学、细胞观察方面有重要意义。
实验中作者取人口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞进行硫瑾染色操作，通过显微观察对巴氏小体进行识别与计数，描述巴氏小体的形态，并统计其在不同性别人体细胞中的出现率。
引言在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体失活并呈异固缩状态，此即为巴氏小体。
又称X小体、性染色质，直径约1μm，通常位于间期核膜边缘。
1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现[1]。
通常人类男性细胞核中很少或没有巴氏小体，而女性有1个，性染色体异常的患者如XXY、 XXYY、XXX、XXXY等，巴氏小体的数量＝X染色体数量－1。
综合巴氏小体与哺乳动物性染色体的剂量补偿效应，Lyon M．F 于1961年提出Lyon 假说，主要内容有：(1)正常的雌性哺乳动物两条X染色体只有一条在遗传上有活性，另外一条失活；(2)X染色体失活是随机的。
因此表达是随机的，结果在杂合子中会出现嵌合现象（mosaic）。
例外：有袋类失活的X染色体全部是父方的。
(3)失活发生在胚胎发育的早期，如人在受精后的16天（5000-6000个细胞时）。
一个细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的后代细胞中该染色体均失活。
Lyon假说虽然可以解释一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner 综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。
随着生物学和医学的发展人们已经认识到单条X染色体失活现象是普遍存在的，但失活的染色体上存在失活区和非失活的。
如人类中位于X染色体上的基因，G6PD（葡萄糖-6磷酸脱氢酶）、AHF（抗溶血第Ⅷ因子）等是非失活的，而Xg血型基因是失活的。
巴氏小体的生物学观察，对于优生学中鉴别性别和预防性连锁疾病的发生，以及作为癌细胞核异常主要形态学特征之一鉴定癌细胞，有重要价值[1]。
X染色质标本-细胞骨架成分-细胞计数
（三）染色
Klinger硫堇染色法 1. 将玻片标本置入1mol/L HCl中， 37℃条件下水解20分钟。 2. 用蒸馏水充分冲洗、晾干。 3. 硫堇染液中染色约15分钟。 4. 蒸馏水冲洗、晾干。
（四）观察 1.先在低倍镜(10倍镜)下观察，可见视 野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。 选择清楚而分散的细胞，移至视野中央， 再换高倍镜仔细观察。口腔上皮细胞为 多边形的扁平状，细胞中央有一被染成 深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。核周 围均质部分为细胞质。细胞的外表为一 很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。 2. 40倍或油镜下检查100个“可计数细 胞”，并计数具有X染色质的细胞数。
2. 用吸管吸去PBS，用 1% Triton X-100 抽提处理细胞 25分 钟。
3. 用吸管吸去Triton X-100 溶液，用 M 缓冲液轻轻漂洗细胞 3 次，（M 缓冲液有稳定细胞骨架的作用）。
4. 略微晾干后，用 3%戊二醛固定细胞 10 分钟。 5. 用PBS（pH7.2）轻轻漂洗细胞 3 次，吸干。 6. 0.2％考马斯亮蓝 R250 染色 5 分钟。 7. 蒸馏水漂洗细胞数次，去除染液，滤纸吸干标本边缘水分，
三、实验用品
（一）材料 显微镜、乙醇(无水乙醇,95％,70％、50 ％)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻 片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸 水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、3％ 醋酸溶液、pH6～6.5缓冲液。
（二）试剂
硫堇染液(工作液)， ①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后过滤备用； ②醋酸钠缓冲液：醋酸钠·3H2O 9.7g， 巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中； ③0.1 mol／L盐酸； 按①：②：③=40：28：32比例配成混 合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。
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作业
1、画1个典型细胞，标明细胞结构及巴氏 、 个典型细胞， 个典型细胞 小体。 小体。 2、计数50个可计数细胞，计算X染色质的 计数50个可计数细胞，计算 染色质的 50个可计数细胞 阳性率。 阳性率。
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X染色质检查的临床应用
正常女性间期细胞 核中X 核中X染色质阳性率 为10％－ ％，而 ％－30％ ％－ 男性则低于1％。 男性则低于 ％。
临床检查时要选择形 态好的细胞观察， 态好的细胞观察，计 200个细胞中 个细胞中X 算200个细胞中X染色 质出现的频率， 质出现的频率， X染 色质出现5 色质出现5％以上者为 女性。 女性。
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蒸馏水冲洗3 蒸馏水冲洗3次 冲洗 冲洗干净， 冲洗干净，晾干 干净
实验结果的观察
• X染色质的识别方法：一 染色质的识别方法： 染色质的识别方法 般位于核膜内侧缘， 般位于核膜内侧缘，形状 多样，多为半圆形， 多样，多为半圆形，三角 形。
可计数细胞的标准： ：核较大， 可计数细胞的标准：a：核较大， 轮廓清除完整，无缺损、皱褶， 轮廓清除完整，无缺损、皱褶， 染色清晰。 ： 染色清晰。b：核质呈细网状或 均匀的细颗粒状， 均匀的细颗粒状，无深染大颗粒 及细菌污染
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Lyon假说： 假说： 假说 1961年由 年由Lyon提出，又称单个活性 染色 提出， 年由 提出 又称单个活性X染色 体假说。 体假说。 1．正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条 ．正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X 染色体中只有一条有活性(activation X, 染色体中只有一条有活性 Xa)，另一条失活 ，另一条失活(inactivation X, Xi)； ； 2．失活是随机的； ．失活是随机的； 3．失活发生在胚胎发育的早期。 ．失活发生在胚胎发育.结构致密的浓染小体，轮廓清楚； 1.结构致密的浓染小体，轮廓清楚； 结构致密的浓染小体 2.大小约1u左右 大小约1u左右， 2.大小约1u左右，常附着于核膜边缘或靠 近内侧； 近内侧； 3.其形状有微凸形、三角形、卵形、短棒 3.其形状有微凸形、三角形、卵形、 其形状有微凸形 形及双球形； 形及双球形；
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人类正常的男女体细胞中，分别有 和 人类正常的男女体细胞中，分别有XY和 XX性染色体，女性的两条X染色体中，在 性染色体，女性的两条 染色体中 染色体中， 性染色体 间期也有一条不表现活性而保持浓缩状态， 间期也有一条不表现活性而保持浓缩状态， 因此易于用适当的染料加以显示， 因此易于用适当的染料加以显示，成为便 于观察的X-染色质（ 小体）。 于观察的 染色质（Barr小体）。 染色质 小体
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X染色质的形成过程
女性： 女性：XX 男性： 男性：XY
女性细胞内X 女性细胞内X染色体上基 因翻译蛋白质的量是男性 的两倍吗？ 的两倍吗？
NO
不论细胞内有几条X染色体， 不论细胞内有几条X染色体，只有一 条是具有转录活性的， 条是具有转录活性的，其余的形成 异固缩的X染色质。 异固缩的X染色质。
核膜
X染色质 染色质
性别的快速鉴定 胎儿性别鉴定 性染色体数目异常辅助诊断
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实验步骤
取口腔上皮细胞涂于载玻片上 甲醇，冰醋酸（ 固定10分钟， 10分钟 甲醇，冰醋酸（3：1）固定10分钟，晾干 1NHcl水解20分钟 NHcl水解20分钟 水解20 卡宝品红染色20分钟 卡宝品红染色20分钟 20 镜检（油镜） 镜检（油镜）
X染色质标本制作和观察
实验目的
掌握X染色质标本制备方法及其原理 掌握 染色质标本制备方法及其原理 了解X染色质的形态特征及临床意义 了解 染色质的形态特征及临床意义
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实验原理
1. 1949年Barr等在此雌 年 等在此雌 猫的神经细胞中发现 一种浓缩小体， 一种浓缩小体，而雄 猫无。 猫无。而且在其他物 种的雌性个体组织细 胞核中都有。因此X 胞核中都有。因此 染色质又称Barr小体。 小体。 染色质又称 小体