聚乙二醇化学改性的大豆分离蛋白凝胶

聚乙二醇化学改性的大豆分离蛋白凝胶刘杰;周浩;黄郁芳;陈新【摘要】将聚乙二醇单甲醚中的羟基氧化成醛基,然后通过Schiff碱及还原反应将聚乙二醇片段接枝到大豆分离蛋白的分子链上.经过聚乙二醇改性的大豆分离蛋白可以在37℃ 自发形成凝胶,且随着聚乙二醇接枝率的增加,凝胶时间可以缩短至30 min以内.因此,经过该乙二醇改性的大豆蛋白水凝胶有望成为一种可注射型水凝胶,在生物医药领域具有相当的应用前景.%Soy protein isolate(SPI), a kind of plant protein, has attracted comprehensive interests in many fields due to its sustainability, low cost, functionality, biocompatibility and tunable degradability. However, SPI needs to take an appropriate modification to meet the requirement of practical use because of the weak intermolecular interactions among the polypeptide chains due to its globular protein nature. Therefore, we designed a chemical modification method to change the aggregation state of SPI molecular chains and prepared a SPI-based hydrogel thereafter. Firstly, polyethylene glycol monomethyl ether(mPEG-CHO) was synthesized by Tempo-BAIB method, achieving an average oxidation degree of 56％. Then, mPEG was successfully grafted onto SPI through Schiff's base reaction between mPEG-CHO and the amino groups in SPI molecular chains, followed by a reduction reaction from NaCNBH4 . It was found that such a PEG modified SPI solution(10％) was able to form a hydrogel at 37 ℃ spontaneously. In the meantime, it showed that with the increase in grafting ratio, the gelation time can be within 30 min. Such a characteristic make this SPI-based hydrogel an injectable hydrogel, whichmay have the considerable potential in the biomedicine field. However, the mechanical properties of current PEG modified SPI hydrogel is still not high enough(storage modulus of 300 Pa), so further effort should be taken to make it meet the requirement of real applications.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2018(039)002【总页数】7页(P390-396)【关键词】大豆分离蛋白;聚乙二醇单甲醚;化学改性;水凝胶【作者】刘杰;周浩;黄郁芳;陈新【作者单位】聚合物分子工程国家重点实验室,复旦大学高分子科学系,先进材料实验室,上海 200433;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院,上海 200031;复旦大学材料科学系,上海 200433;聚合物分子工程国家重点实验室,复旦大学高分子科学系,先进材料实验室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】O636作为一种原产于中国的农作物, 大豆含有40%的蛋白质, 35%的碳水化合物, 20%的脂质和5%的灰分. 经过提取和去脂化过程, 大豆蛋白粉中包含50%的蛋白质, 其中90%的蛋白质是以球状蛋白的形式存在[1]. 目前, 市售的大豆蛋白主要有大豆粉(SF, 约含有53%～55%的蛋白质)、大豆浓缩蛋白(SPC, 约含65%～72%的蛋白质)和大豆分离蛋白(SPI, ≥90%的蛋白质)3种[2]. 因此大豆分离蛋白是一种来源广泛、价格低廉、可再生的植物性蛋白质, 作为一种可持续的天然原料具有广泛的应用前景. 大豆蛋白经过处理或改性后, 可以加工成凝胶、薄膜、黏合剂、涂料、乳化剂及塑料等材料. 目前对于大豆蛋白的相关研究主要集中在大豆蛋白凝胶和薄膜材料, 并将其应用到生物医药和食品包装等方面[3,4]. 大豆蛋白是一种球蛋白, 在自由状态下分子链间的缠结较少, 分子间相互作用较弱, 因此大豆蛋白材料在力学性能和水阻隔性等方面表现不佳. 纯大豆蛋白一般很难作为成品材料直接使用, 需要采用一定的改性手段或方法来改善其性能以满足不同应用领域的需求[4,5]. 化学改性法是利用蛋白质上存在的大量残余官能团(氨基、羧基和羟基等)与某些特定的小分子化合物和聚合物等发生化学反应. 这些反应包括Schiff 碱反应、 Click 反应和原位自由基聚合等[6], 并且被广泛应用于明胶[7]、丝蛋白[8]和小麦蛋白[9]等一些蛋白质的化学改性过程.近些年, 在蛋白质表面修饰聚乙二醇(PEG)已经成为一种改善蛋白质材料性能的重要手段. 此方法具有以下优势: (i) 减小肾脏对蛋白质的清除率, 从而延长蛋白质在体内的循环时间; (ii) 增加蛋白质的亲水性, 特别是针对一些溶解性较差的蛋白质药物, 可提高其生物利用度; (iii) 可以有效减轻或中和蛋白质的毒性或过敏等不良免疫反应[10,11]. 聚乙二醇修饰的大豆蛋白材料植入到动物体内时并不会引发严重的炎症反应, 是一种具有免疫惰性的材料[12].本文采用聚乙二醇对大豆分离蛋白进行改性, 即先将聚乙二醇单甲醚进行醛基化,再通过Schiff 碱反应将其接枝在大豆分离蛋白分子链上, 并对改性后大豆分离蛋白的凝胶化性能进行了探讨.1 实验部分1.1 试剂与仪器大豆分离蛋白(SPI)购于上海深远食品有限公司, 其中蛋白质含量大于91%. 盐酸胍、溴化钾、氘代氯仿(CDCl3)和重水(D2O)均购于国药集团化学试剂有限公司; 碘苯二乙酸酯(BAIB)和四甲基哌啶氧(Tempo)购于梯希爱化成工业发展有限公司; 二硫苏糖醇(DTT)和氰基硼氢化钠(NaCNBH3)购于Aladdin公司; 聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH, 2000)购于Sigma-Aldrich公司. 以上试剂均为分析纯. 实验用水均为去离子水.Nicolet Nexus 6700傅里叶变换光谱仪(Thermo Fisher, USA); AVANCE Ⅲ HD 型液体核磁共振仪(Bruker, Switzerland); Physica MCR301流变仪(Anton Paar, Austria); FEI-600型透射电子显微镜(Tecnai, USA).1.2 实验过程1.2.1 大豆分离蛋白粉末的制备参考文献[13]方法得到大豆分离蛋白粉末.1.2.2 聚乙二醇单甲醚的氧化聚乙二醇单甲醚的氧化参照文献[14]方法: 在100 mL 圆底烧瓶中, 将聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH, 2 g)溶于10 mL无水二氯甲烷中, 分别加入一定量的碘苯二乙酸酯和四甲基哌啶氧, 其中聚乙二醇单甲醚中羟基、四甲基哌啶氧和碘苯二乙酸酯的摩尔比为1∶0.2∶3. 常温下反应6 h后, 继续搅拌过夜使其充分反应. 反应结束后向溶液中加入100 mL冷无水乙醚使产物析出, 真空抽滤. 粗产物用少量二氯甲烷溶解后, 再加入冷无水乙醚, 抽滤, 反复2～3次以去除小分子杂质, 真空干燥得到白色混合物(原料和氧化产物的混合物).1.2.3 聚乙二醇改性大豆分离蛋白的制备将3 g大豆分离蛋白粉末溶于磷酸盐缓冲液(pH=7.6, 0.01 mmol/L)中配成质量分数为2%的溶液, 加入5 mg二硫苏糖醇继续搅拌2 h以破坏其中的二硫键. 然后加入不同含量的聚乙二醇单甲醚的氧化产物(mPEG-CHO), 使其与蛋白质中残余的氨基发生Schiff碱反应, 其中氧化聚乙二醇中的醛基与大豆分离蛋白质中的赖氨酸上游离氨基之间的摩尔比分别设定为20∶1和10∶1. 常温反应3 h后加入10倍过量于醛基的氰基硼氢化钠, 对生成的CN双键进行还原[15]. 继续反应24 h后, 将反应液装入截留分子量为12000的透析袋中进行透析, 透析第1天在去离子水中加入2 mmol/L氢氧化钠溶液调节pH至10左右, 第2天加入的氢氧化钠量逐渐减少, 直至第3天用去离子水透析. 透析完成后, 溶液在转速为9000 r/min的离心机上离心10 min以除去不溶物. 产物在-20 ℃的冰箱中冷冻过夜, 然后进行冷冻干燥, 冻干后获得的固体粉末用过量丙酮洗涤2～3次, 真空干燥得到最终产物, 分别记为SPI-g-mPEG 20∶1和SPI-g-mPEG 10∶1.1.2.4 聚乙二醇改性大豆分离蛋白凝胶的制备取一定量改性前后的大豆分离蛋白粉末溶于去离子水, 配成质量分数为10%的溶液, 低速离心去除气泡后放置在37 ℃水浴中孵化, 并用倒置法记录凝胶时间.1.2.5 红外光谱测试采用Nicolet Nexus 6700傅里叶变换光谱仪测定. 在室温下将样品与KBr混合压片, 扫描64次, 分辨率为4 cm-1, 测试范围为500～4000 cm-1.1.2.6 核磁共振氢谱(1H NMR)测试采用AVANCE Ⅲ HD型液体核磁共振仪测定. 测试条件: 共振频率为500 MHz, 采样次数32次, 采样时间为1.0 s, 脉冲延迟为6.0 s, 谱宽为δ 16.取5～10 mg氧化前后聚乙二醇单甲醚加入到核磁管中, 用0.5 mL氘代氯仿(CDCl3)溶解, 测定1H NMR. 以聚乙二醇中的重复链段(—CH2—CH2O—)在δ 3.45～3.90(m, 176H)处的所有氢原子数目为内标, 同时采用聚乙二醇单甲醚中端甲基上的3个氢原子—CH3δ 3.38(s, 3H)为参照标准计算氧化度(OD, %). 根据这2个峰的积分面积计算聚乙二醇单甲醚的氧化度. 计算公式如下:(1)(2)式中: A3.38是端甲基上的3个氢原子δ 3.38处的积分面积; A4.16为氧化产物中与醛基相连的亚甲基(—CH2—CHO)在δ 4.16处的积分面积; 式(1)中的数值1.5为上述2种氢原子数目的比值; A(3.45-3.9)为聚乙二醇单甲醚重复链段(—CH2—CH2O—)在δ 3.45～3.9处的积分面积; 式(2)中的数值83.5为聚乙二醇重复片段中氢原子个数与端甲基中氢原子个数的比值.测定聚乙二醇改性后大豆分离蛋白样品的 1H NMR. 在核磁管中加入一定量冻干的改性蛋白质粉末(约20 mg), 加入含有氢氧化钠的重水溶液进行溶解. 用重水配置10 mg/mL的吡嗪溶液, 取100 μL加入到上述核磁管中进行测定. 对于大豆分离蛋白上聚乙二醇单甲醚的接枝量, 采用 1H NMR谱中特征吸收峰(端甲基δ 3.5)的积分面积进行计算, 其接枝率ωu(%)表达式为(3)式中: ma(mg)是加入内标物吡嗪的质量; mu(mg)是加入改性后大豆分离蛋白样品的质量; Aa为吡嗪分子中所有氢原子特征峰的积分面积之和; Au为样品中甲氧基官能团在δ 3.5位移处的峰面积; Ea为吡嗪的质子当量, 为吡嗪的相对分子量与分子中所有氢个数的比值, 其值为20.0; Eu为样品中甲氧基的质子当量, 为聚乙二醇单甲醚的分子量与甲氧基中氢原子个数的比值, 其值为666.7.1.2.7 流变性能测试采用Physica MCR301流变仪, 平板模式(PP25)测定聚乙二醇改性大豆分离蛋白凝胶的流变行为, 上下板的间距为1 mm, 测试温度为37 ℃. 进行频率扫描时, 应变固定为0.5%, 频率变化范围为0.1～100 Hz. 在流变测试中, 凝胶的用量均为1 mL, 且在夹具边缘滴加低黏度的矿物油(黏度约为10 mPa·s), 用以阻止水分的挥发.1.2.8 透射电子显微镜观察分别配置质量分数为0.5%的纯大豆分离蛋白和改性后的大豆分离蛋白溶液, 使用吸管将溶液分别滴在铜网上, 1 min后用滤纸吸走剩余溶液; 然后将少量的醋酸双氧铀溶液(2%)滴在铜网上, 染色1 min后用滤纸吸去剩余溶液, 室温干燥. 用于透射电子显微镜测试, 测试电压为120 kV.2 结果与讨论2.1 聚乙二醇单甲醚醛基化产物的制备与表征在无水条件下, 使用Tempo-BAIB催化体系能够将聚乙二醇单甲醚分子链上的端羟基选择性氧化成醛基. 反应式见Scheme 1. 在此氧化体系中, 利用碘苯二乙酸酯中高价态的碘原子作为氧化剂, 以少量的四甲基哌啶氧为催化剂, 室温条件下在二氯甲烷溶液中可发生高度选择性的氧化反应[14].Scheme 1 Synthesis of mPEG-CHOFig.1 FTIR(A) and 1H NMR(B) spectra of mPEG-OH(a) and mPEG-CHO(b) 图1(A)为氧化前后聚乙二醇单甲醚的红外光谱. 2887 cm-1(C—H伸缩振动)、1466 cm-1(C—H的变形振动)、 1350 cm-1(C—H的摇摆振动)、 1280 cm-1(C—H的扭转振动)和1101 cm-1(C—O—C的伸缩振动)处的吸收峰均属于聚乙二醇单甲醚上重复片段—CH2CH2O—的特征吸收峰[16,17], 不同的是氧化后的产物在1740 cm-1处出现1个新的吸收峰, 该吸收峰为CO特有的伸缩振动峰; 另外在3200～3400 cm-1处宽峰(—OH伸缩振动)的强度在氧化后发生明显的下降, 这些峰位的变化都表明聚乙二醇单甲醚上端羟基已被氧化.图1(B)为聚乙二醇单甲醚氧化前后的核磁共振氢谱. 氧化后的产物在δ 9.7(s, 1H)处出现1个新峰, 该特征峰对应着醛基上的氢原子(—CHO), 而非羧基上的氢原子. 此外在δ 4.16(s, 2H)处出现的新峰对应与醛基相连的亚甲基上的氢原子(—CH2—CHO)[18,19]. 因此根据式(1)和(2), 可以计算出聚乙二醇单甲醚的氧化度分别为58.7%和53.8%, 且2个数值相差并不大, 因此取其平均值作为聚乙二醇单甲醚的氧化度(56.3%). 很明显最终产物是原料和单醛的混合物, 很难通过简单的分离操作进一步纯化, 但是这并不影响后续的接枝反应.2.2 聚乙二醇改性大豆分离蛋白的制备与表征大豆分离蛋白上含有大量的碱性氨基酸残基中的氨基, 如赖氨酸, 这些氨基酸的残基(—NH2)具有良好的反应活性, 能与醛、酸等基团反应, 从而使带有这些官能团的小分子或聚合物能够接枝到蛋白质分子链上[20]. 因此, 氧化聚乙二醇产物上的醛基可与蛋白质上的氨基发生希夫碱反应, 并且此反应通常非常高效. 通过氰基硼氢化钠的还原作用, 可将CN双键还原为更为稳定的C—N单键, 从而可将聚乙二醇片段接枝到蛋白质分子链上(Scheme 2)[21].Scheme 2 Synthesis of mPEG modified SPI反应后混合物经过透析、洗涤等方法可以将氧化前后聚乙二醇单甲醚去除干净, 干燥后产物的红外光谱如图2(A)所示. 可以看出, 位于1654和1538 cm-1处的2个强吸收峰分别代表蛋白质的酰胺Ⅰ和Ⅱ带[13]; 而对于改性的2种大豆分离蛋白, 在1103 cm-1处的吸收峰显著增强, 而此处吸收峰对应于聚乙二醇单甲醚分子链上的C—O—C的伸缩振动, 表明聚乙二醇片段已经接枝到大豆分离蛋白的分子链上[20].Fig.2 FTIR(A) and 1H NMR spectra(B) of pristine SPI(a), SPI-mPEG10∶1(b) and SPI-mPEG20∶1(c)由于mPEG分子链末端上存在甲氧基(—OCH3)官能团, 且大豆分离蛋白的20种氨基酸残基中不存在甲氧基, 因此在核磁氢谱中出现在δ 3.32(s, 3H)处甲氧基的特征耦合峰[16]表明聚乙二醇单甲醚已接枝到大豆分离蛋白的分子链上[图2(B)]. 同时, 在蛋白质溶液浓度相同的情况下, 随着聚乙二醇单醛投料量的增加, 甲氧基耦合峰的强度也随之增加, 证明接枝到大豆分离蛋白上的聚乙二醇含量也逐渐增加. 当加入吡嗪作为内标物, 通用内标物与特征峰的积分面积计算聚乙二醇单甲醚的接枝率[式(3)], 可以得出不同的投料比获得的2种改性大豆蛋白中聚乙二醇片段的接枝率分别为9.5%和15.6%.2.3 聚乙二醇改性大豆分离蛋白的形貌采用醋酸双氧铀对聚乙二醇改性前后的大豆分离蛋白溶液进行染色, 其透射电镜照片如图3所示. 由图3(A)可见, 纯大豆分离蛋白溶液在铜网上干燥后呈分散的不规则颗粒, 表明其分子链之间相互作用很弱, 分子链之间缠结较少, 溶液干燥后自发地向球状聚集体形式转变[13]. 但是, 当聚乙二醇片段接枝到大豆分离蛋白的分子链以后, 其溶液干燥后呈现出完全不同的形貌, 即形成网状结构[图3(B)]. 与采用氯代二乙基亚磷酸酯和四羟甲基氯化磷对大豆分离蛋白进行磷酰化改性的工作相似[13,22], 较大分子量聚乙二醇片段的引入一方面可以破坏大豆分离蛋白原有的三级结构, 即接枝在大豆分离蛋白上较长的聚乙二醇链具有较明显的位阻效应, 在一定程度上破坏了大豆蛋白分子链自发折叠形成原有球状结构的能力; 另一方面, 接枝在大豆分离蛋白上聚乙二醇链可以与其它大豆蛋白分子链间形成相互作用(如氢键和疏水相互作用), 进一步阻止大豆分离蛋白形成原先较紧密的球状结构, 使分子链变得较舒展; 这些相互作用还可能起到类似交联的作用, 从而使溶液干燥后的形貌呈现出网状结构.Fig.3 TEM images of pristine SPI(A) and mPEG modified SPI(B)2.4 聚乙二醇改性大豆分离蛋白凝胶性质众所周知, 纯大豆分离蛋白溶液在常温下较难自发形成水凝胶, 而经过聚乙二醇改性的大豆分离蛋白水溶液能够在不添加任何交联剂的情况下, 在37 °C的生理温度下形成水凝胶(图4). 同时, 随着接枝率的增加(从9.5%至15.6%), 凝胶时间可以由70 min缩短至30 min. 这一性能(生理温度下较短时间内形成水凝胶)有望使该水凝胶成为一种可注射型水凝胶而用于生物医用领域. 究其能自发形成水凝胶的原因, 如前所述, 首先大豆分离蛋白分子链上引入聚乙二醇片段后, 位阻效应使得聚集的蛋白质分子链发生解缠结作用(一般而言, 球状蛋白通过非化学交联作用形成凝胶, 其第一步是需要打开其球状聚集的分子链, 即解缠结过程[23]), 使大豆蛋白分子链上更多的亲水和疏水片段暴露出来. 其次, 接枝在大豆分离蛋白上的聚乙二醇片段也能提供额外的形成氢键和疏水相互作用的位点. 这两者的协同作用最终导致大豆分离蛋白分子间的相互作用(如氢键和疏水相互作用)明显增加, 从而形成三维网状结构, 即水凝胶[23,24].Fig.4 Optical images of pristine SPI(A, B) and mPEG modified SPI(C, D) solution before(A, C) and after(B, D) incubation at 37 ℃Solution concentration: 10%.改性后大豆分离蛋白凝胶的流变行为如图5所示. 从图5(A)可以看出, 当应变在2%以下时, 凝胶可维持其状态; 而当应变超过2%时, 凝胶结构会遭到破坏. 对改性后的大豆分离蛋白凝胶进行频率扫描, 可以发现其储能模量(G′)和损耗模量(G″)能够在较大的频率范围内保持稳定, 其储能模量约为300 Pa[图5(B)]. 由此可见, 改性大豆分离蛋白在37 ℃下自发形成的水凝胶, 其力学性能稍差, 尚未达到实际使用的标准, 因此需进一步提高其力学性能, 如采用与其它材料复合的方法, 进一步的工作正在进行中.Fig.5 Rheological test of mPEG modified SPI hydrogel at 37 ℃(A) Strain sweep; (B) angular frequency sweep.3 结论采用一种温和的氧化法将聚乙二醇单甲醚中的羟基氧化成醛基, 红外光谱和核磁共振氢谱结果均表明醇羟基被氧化, 氧化度约为56%. 利用Schiff 碱反应和还原反应将聚乙二醇片段接枝到大豆蛋白的分子链上, 2种投料比获得的产物其接枝率分别为9.5%和13.6%. 聚乙二醇改性后大豆分离蛋白溶液在37 ℃的生理温度下可以自发形成凝胶, 作为一种可注射水凝胶在生物医用领域具有一定的应用前景.参考文献【相关文献】[1] Kinsella J. 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