霉菌和酵母计数GB
7-2第七章食品微生物检验-霉菌和酵母计数
2.培养
倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察， 共培养观察5d。
• 待培养基凝固后，将培养皿放入恒温培养箱。
提示：培养皿放入培养箱时要倒置。 • 注意选择设置为28℃±1℃的培养箱。
3.计数
• 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀 释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形 成单位（colonyforming units，CFU）表示。
对 照
10-2
10-3 CFU
/ml(g)
霉菌 和酵 母
CFU /ml(g)
（2）液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌 蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中， 充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
（3）取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一 支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。
（4）按（3） 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀 释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。
固
体
10mL
样
品
10-
1
吹吸50次， 1mL
10-
2
吹吸5次， 1mL
10-
3
吹吸5 次，
1mL
1mL
灭 菌 蒸 馏 水
25g+225m L灭菌蒸馏水
10-1
-1
-2
-3
空白
-1
-2
-3
空白
提示：样品加入稀释液管后，要先吹吸， 后取1mL样液加入培养皿。
（5）根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适 宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样 品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照
GB 4789.15霉菌和酵母计数
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霉菌和酵母的基本特性
相对于低等的细菌来说，霉菌 和酵母生长缓慢，竞争能力较弱， 故霉菌和酵母常在不利于细菌生长 繁殖的环境中形成优势菌群。由于 霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢 能力强，故10２～10４个酵母即可引 起一克食物的变质，而细菌则需要 100倍于此数的细胞。
6.1 计算两个 平板菌落数的 平均值，再将 平均值乘以相 应稀释倍数计 算。
6.6 报告：每克(或 毫升)食品所含霉
菌和酵母数以 cfu/g(mL)表示。
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6 结果与报告
6.1.2 若所有平板
6.6 报告：每克
6.3 取1 mL1:10稀释 液注入含有9 mL灭
菌水的试管中，另 换一支1 mL灭菌吸 管吹吸5次，此液为 1:100稀释液。
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5 操作步骤
5.1 样品的稀释
5.1.4 按5.1.3操作程 序，制备10倍系列稀 释样品匀液。每递增 稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管。
6.5 计算方法：通常选择 菌落数在10～150之间的 平皿进行计数，同稀释 度的2个平皿的菌落平均 数乘以稀释倍数，即为 每克(或毫升)检样中所含 霉菌和酵母数。稀释度 选择及菌落报告方式可 参考GB/T 4789.2。
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后开始观察，共培 养观察5 d。
霉菌和酵母菌计数
— 1—
• 样品的制备
检
1.固体和半固体样品的制备：
测
称取25 g样品,加人225 mL无菌稀释液(蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液),
方
充分振摇,或用拍击式均质器拍打1 min-2min，制成1 : 10的样品匀液。
法
— 1—
• 样品的制备
检
2.液体样品的制备：
测
以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无茵稀释液(蒸馏水或生理盐水
方
或磷酸盐缓冲液)的适宜容器内(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)
法
或无菌均质袋中,充分振摇或用拍击式均质器拍打1 min-2 min,制成1-
10的样品匀液。
— 1—
• 接种及培养
检
1.系列稀释：
测
取1 mL 1: 10样品匀液注人含有9mL无菌稀
25ml
1ml
方
释液的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹
告
和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌
落蔓延。
— 1—
• 结果报告
① 计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值,
计
再将平均值乘以相应稀释倍数。
数 报
② 若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU-
告
150 CFU之间,则按照GB 4789.2的相应规定进行
计算。
③若所有平板上菌落数均大于150 CFU,则对稀释
方 法
倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1 mL样品
匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL无菌稀释
液加人2个无菌平皿作空白对照。及时将20 mL-25
mL冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红琼
脂(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注
国标食品微生物学检验 霉菌酵母菌计数
1、检验食品中的霉菌、酵母菌有何意义？试举例食品中产毒素的霉菌、酵母菌？酵母菌是人类较早应用于制作面包、酿酒等的一类微生物。
近年来的应用越来越广，酵母菌体可供食用和作饲料，并可提取核酸、辅酶A、细胞色素C、凝血质等贵重药品；利用其代谢产物，制取维生素、有机酸和酶制剂等；同时，也可用于石油发酵和石油脱蜡等；霉菌除用于传统的酿酒、制酱和做其他发酵食品外，近年来在发酵工业中广泛用来生产酒精、柠檬酸、青霉素、灰黄霉素、赤霉素、淀粉酶、发酵饲料等。
腐生型酵母能使食物、纺织品和其他原料腐败变质；少数嗜高渗压酵母菌如鲁氏酵母、蜂蜜酵母可使蜂蜜、果酱败坏；有的是发酵工业的污染菌，它们消耗酒精，降低产量或产生不良气味，影响产品质量。
面包内含有淀粉，容易滋生霉菌，霉菌会分解淀粉，产生有毒黄曲霉素，是强致癌物质。
根霉经常出现在淀粉质食品上，引起食品霉烂变质，有些曲霉菌能产生对人体有害的物质，如黄曲霉毒素。
2、如何在菌落形态上鉴定霉菌、细菌、酵母菌？细菌：小而突起，大而平坦，透明或半透明，易挑取，粘稠，有臭味，质地均匀菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致，圆形菌落，颜色有白色、黄色等。
放线菌：正面有白点而且正背面颜色不同，干燥，小而紧密，与培养基结合牢固（难以挑取），不透明，泥香味，菌落背面有同心圆形纹路。
这点可以和细菌菌落区分。
酵母菌：菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。
霉菌：有菌丝，干燥，大而疏松，有霉味而且透明，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，如绒毛状或棉絮状，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。
菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子有不同形状、构造和色素，菌落表面常出现肉眼可见的不同的结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等各色。
有的霉菌由于产生的色素能扩散到培养基内，使培养基正面和反面显示出不同颜色，故菌落特征也是鉴定霉菌的主要依据之一。
3、该实验只进行霉菌总数的测定而如何进行霉菌的分离与鉴定？(在土壤中，将10-2、10-3各1ml稀释液接于马丁氏培养基)一、配制培养基（根据试剂瓶上的配比）每个培养皿装15~20ml，有7个培养皿，每组近似配150ml(20*7=140ml取最大范围)；二、取两个100或150ml的三角瓶，其中一个用于装90ml的蒸馏水，使用硅胶塞（用于配样品），另一个用于装50~60ml蒸馏水（五根试管，5*9=45ml）,用报纸包扎；三、包扎枪头（10个），将培养基放置于一个铁笼子，再将枪头和两瓶水放置于另一个铁笼子，进行湿热灭菌。
霉菌和酵母菌介绍及检测方法
霉菌和酵母菌介绍及检测方法一、霉菌和酵母菌介绍：霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类,通常是单细胞，呈圆形，卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
长期以来,人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美;还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。
但在某些情况下,霉菌和酵母也可造成中腐败变质。
由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现,这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长;有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素.霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味.例如,酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。
目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准.我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
二、检验方法：霉菌和酵母的计数方法,与菌落总数的测定方法基本相似。
主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数.对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。
具体检测标准参见：GB4789.15—94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明：1．样品的处理。
为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。
对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料,再混合磨碎.如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。
霉菌和酵母菌计数及分离培养
品种名称：马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)
英译名称：Potato Dextrose Agar
Potato dextrose agar medium with antibiotics
培养基用途：
供霉菌和酵母菌计数及分离培养(GB4789.15-2010和ISO标准)。
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)使用原理：
马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长;葡萄糖提供能源;琼脂是培养基的凝固剂;氯霉素可抑制细菌的生长。
马铃薯葡萄糖琼脂配方(每升)：
马铃薯 300g(从中提取浸出粉)
葡萄糖 20g
琼脂15g
氯霉素0.1g
最终pH 6.0±0.2
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)使用方法：
1、称取马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)40.1g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌20min，备用。
2、霉菌和酵母菌计数。
3、用于霉菌分离鉴定。
马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)质量控制：
本品倾注平皿，下列菌株接种后25—28℃培养72h生长情况如下表。
菌名菌号生长状况菌落特征
黑曲霉ATCC16404 良好菌丝白色孢子黑色
白色念珠菌ATCC10231 良好菌落表面呈奶油色
大肠埃希氏菌ATCC25922 被抑制——
金黄色葡萄球菌ATCC6538 被抑制——
贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。
贮存期三年。
规格： 250g。
霉菌及其酵母菌
1、样品的稀释培养
（1）以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含
有225mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，振摇30min，
即为1：10稀释液。
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，
沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌蒸馏水的试管内，
振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
（3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，
制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换
用1支1mL灭菌吸管。
（4）根据标准要求或对污染情况的估计，选
择3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的
同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液
于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
及时将15mL～20mL 冷却至46℃的马铃薯-葡 萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于 46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转 动平皿使其混合均匀。 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养 5d，观察并记录。
制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊 呈烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着 生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。 制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈 烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着生 ，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。
二、黄曲霉毒素检测方法
可归纳为化学方法、生物学方法和免疫学方法 三大类。 1、生物学方法 1. 抑菌试验 通过平皿中抑菌圈大小来衡量AFT含量 2. 荧光测定法 将待检菌株接种于培养基中，28—30 ℃培养48 ～72h，产生的毒素便浸入培养基中，在紫外灯光 下照射培养基会呈现出特异的荧光。此法操作简便 对AFT最低检出量为5pg/mL(拷贝数/毫升)。 3. 动物试验 大白鼠试验法、鸡胚试验、鸭雏试验
霉菌及酵母菌计数测定方法操作规程
食品中霉菌及酵母菌计数测定方法操作规程一、范围本规程规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。
本规程适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。
二、编写依据GB 4789. 15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母菌计数》三、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱：21〜5（。
3.2恒温培养箱：28o C±ΓCo3.3均质器。
3.4恒温振荡器。
3.5 显微镜：10×-100×o3.6电子天平：感量0. 1g。
3.7无菌锥形瓶：容量500mL. 250mLo3.8无菌广口瓶：500mLo3.9无菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10mL（具0. 1mL刻度）。
3.10无菌平皿：直径90mmo4.11 无菌试管：10mm×75mmo5.12无菌牛皮纸袋、塑料袋。
四、培养基和试剂6.1马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：同GB 4789. 15项下制法。
6.2孟加拉红培养基：同GB 4789. 15项下制法。
6.3氢氧化钠Imol/L： 8g配200ml蒸储水。
6.41ICL lmol/L：7. 3g 配200ml 蒸储水。
五、检验程序5.1样品的稀释5.1.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸储水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。
或放入盛有225 mL无菌蒸储水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min,制成1:10的样品匀液。
5.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品至盛有225 mL无菌蒸储水的锥形（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
7.1.3取1 mL 1:10稀释液注入含有9 mL无菌水的试管中，另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，此液为1： 100稀释液。
5.1.4按5. 1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
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选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿， 倾注培养基后，培养观察，计数。 对霉菌的计数，还可以采用显微镜 直接镜检计数的方法。
霉菌和酵母菌及其检验
三、程序:
1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被
检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品
样品采集：
可疑食物 病人血清在未使用抗毒素治疗前采集
（4-5ml） 病人粪便 疑似患者外伤感染后的坏死组织或者是
渗出液
肉毒梭ห้องสมุดไป่ตู้及肉毒毒素检验
1 增菌（产毒培养） 2 分离培养 3 菌落特征及菌体形态 4 菌落特征及菌体形态 5 生化试验 6 肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落
霉菌和酵母菌及其检验
4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每 个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立 即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反 方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来 放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下 生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观 察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。
5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板 进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌 落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单 位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选 择可参考细菌菌落总数测定。
霉菌和酵母菌及其检验
6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方 法进行计数。
上清液稀释500倍
上清液稀释5000倍 明胶磷酸盐缓冲液（对照组）
接种量 小白鼠 数
0.5ml 4 只
0.5ml 4 只 0.5ml 4 只
0.5ml 4 只
0.5ml 2 只
0.5ml 2 只
0.5ml 2 只 0.5ml 2 只
结果
4h死 亡 存活 4h死 亡 6h死 亡 16h死 亡 20h死 亡 存活 存活
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
分纯后主要生化鉴定
明胶 硫化 硝酸 葡萄 麦芽 乳糖 蔗糖 氢盐 糖 糖
+
+－ +
+ —+
肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）
标本处理
上清液+10%胰酶水溶液（9：1） 37℃1小时 上清液+缓冲液煮沸10分钟 庖肉增菌48小时15分钟/2000转，取上 清液 上清液
上清液稀释50倍
样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。
如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。
液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。
2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增
稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉
菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。
菌落特征及菌体形态
普通琼脂平板上形成直径3-5mm不规则 菌落、半透明、绒毛样边缘扩散生长
血平板上形成发丝状或盘状的灰色菌落 有β-溶血
卵黄琼脂平板菌落及周围培养基上能分 解脂肪表面覆盖着特有的虹彩样薄层和 珠光层
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
生化试验
肉毒梭菌的生化反应变化 很大，同一型各菌株之间也不 完全一致。
微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。
分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径
几乎相同，有分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
肉毒梭菌是厌氧性梭状芽胞杆菌属的一种。该 菌在厌氧环境中能分泌极强烈的肉毒毒素，引 起特殊的神经中毒症状
肉毒毒素通过消化道粘膜吸收，经血液扩散至 全身，主要侵犯中枢神经系统，因而表现出一 系列的神经症状。
3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几
种选择性培养基。
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）
孟加拉红（虎红）培养基
高盐察氏培养基
霉菌在孟加拉红培养基上典型特征
霉菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落， 有黑色孢子 。
酵母菌在孟加拉红培养基上典型 特征
酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为 红色菌落
主要临床特点：发病初期为无力、腹部不适、 咽部发紧、呕吐，继而出现声音嘶哑、饮水发 呛、吞咽困难、眼睑下垂、复视等眼部症状。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
培养基、试剂
明胶磷酸盐缓冲液 10%胰酶水溶液（酶活力1：250） 庖肉培养基 卵黄琼脂培养基 肉毒分型抗毒诊断血清 革兰氏染色
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
食品卫生微生物学检验
GB/T 4789 -2003
1、霉菌和酵母计数 2、肉毒梭菌及肉毒毒素检验 3、罐头食品商业无菌的检验 4、乳酸菌检验
一、霉菌和酵母计数
1 范围 2 规范性引用文件 3 设备和材料 4 培养基和试剂 5 检验程序 6 操作步骤
霉菌和酵母菌及其检验
二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总
0.5ml 2 只
存活 7h内死亡 存活
5h内死亡
定型试验说明
标本中的肉毒毒素可被肉毒多价抗毒素 和B型抗毒素中和起到保护小白鼠免于死亡 的作用。
上清液煮沸10分钟可以破坏肉毒的毒素 证明标本中含有毒素。
此次样品检出结果为B型肉毒毒素
罐头食品商业无菌的检验
1 范围 2 规范性引用文件 3 术语与定义 4 设备和仪器 5 培养基和试剂 6 检验步骤 7 结果判定
定型试验
标本处理（抗毒素1ml+9ml上清液1：20 1ml）接种量 小白鼠 数
A-F混合型肉毒抗毒素
0.5ml 4 只
A型肉毒抗毒素
0.5ml 4 只
结果
存活 12h内死亡
B型肉毒抗毒素
E型肉毒抗毒素
对照组：上清液+缓冲液（1：1）煮沸10分 钟 对照组：上清液+缓冲液（1：1）
0.5ml 4 只 0.5ml 4 只 0.5ml 2 只
在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征：
平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是
一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区
别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。
横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的
菌丝没有横隔。
菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显