(整理)分子生物学试题

分子生物学思考题：

一、名词解释：

（1）基因座位（Gene locus）：指各个基因在染色体上所占的位置。也可简称为座位。但就位点的实体而言，指的就是基因。

（2）纯合子（homozygous）：是指同一位点(locus) 上的两个等位基因相同的基因型个体，即遗传因子组成相同

（3）杂合子（heteroxygous ）：是指同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体

（4）野生型（wild type）:指在野生群体中观察到的最高频率的表型，或具有这种表型的系统、生物和基因。

（5）

（6）突变型（mutant）:即生物体的性状出现突变的个体、细胞或病毒粒子，称为突变型，也有人把发生了突变的基因本身称为突变型的，根据变化的

性状可以将突变型分为形态突变型、代谢突变型和行为突变型等。

（7）载体（vector）可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。

（8）

（9）基因克隆经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。

（10）质粒（plasmid）是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA,存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，

如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。

（11）α-互补指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由1024 个氨

基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。

（12）

（13）DNA文库某一特定来源DNA通过细胞-DNA克隆技术构建呈含有所用DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。

二、简答题：

1.

2.1944年， Oswald Avery 和他的同事证

实了遗传物质是核酸，而非蛋白质，请简述Avery实验的原理及方法。细菌学家们曾研究过在实验室中生长的两种不同的肺炎球菌菌株，一种有平滑的外膜（S），一种没有外膜，外表粗糙（R），显然R菌株缺少某种构成这种碳水化物被膜的酶。同时发现，如果将S 菌株的浸出物与R活菌株相混合，注射于小鼠，小鼠的组织中就会含有S活菌株。S浸出物（完全是非活性的）显然含有一种因子，能够供给R菌株以所需要的酶，并将之转变成S菌株。大家都认为这种因子本质上是蛋白质。然而在1944年艾弗里及共同事研究了S菌株浸出物，证实这种因子是纯粹的脱氧核糖核酸（DNA），并不存在蛋白质。

这是一个关键性发展，在此以前，一直认为蛋白质是遗传学的基础，而DNA只是蛋白质的一种不怎么重要的附属品。现在看来DNA才是真正的遗传学基础。这一发现直接导致了对DNA的新的钻研，使克里克和沃森发现了它的结构及其复制方式。

3.Francois Jacob非特异性核糖体假说实

验验证的原理及实验方法。

3.原核生物启动子五个保守区域的特点？启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：

（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。

启动子有强弱之分，虽然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA的合成，但它却不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。4PCR引物设计的原则？①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含

量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

5作为载体的DNA分子需要具备哪4个条

件？①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制。②具有多个克隆位点(multiple cloning site,MCS,或称polylinker region),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA 片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。④易从宿主细胞中吸收。

6简述Ti质粒的特点及其衍生载体。(1) Ti质粒具有5个主要功能区域。它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿碱代谢(opine catabolism)、复制原点(oir)和毒性区域(vir)。

(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfect direct repeat)，右端的这段序列称为右界（right border，RB），左端的序列称为左界(left border，LB )。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。

(3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA 转移。Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。

衍生载体-----双元载体这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。共整合载体(integrated vector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒(如Pmon200)，另一个带有毒性基因(如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。

三、论述题：

1结合自已的研究领域，举例说明分子生物学知识在研究中的应用 1.1核酸探针检测技术

以核酸分子杂交技术为核心，利用探针分析DNA序列及片段长度多态性*探针是能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，它可以是长探针（100～1000bp），也可以是短核苷酸片段（10～50bp），可以是从RNA制备cDNA探针，也可以是PCR产物或人工合成的寡核苷酸探针。根据碱基互补配对的原则，

被标记（放射性或非放射性的）的核苷酸探针以原位杂交、Southern(印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法，可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列)由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术广泛应用于对环境中的生物的检测，定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。

基因探针方法学利用了DNA能变性和重退火的特性。要做一个基因探针，所研究的这个基因的DNA顺序必须清楚。这个基因对一特定的微生物种可能是独特的，在这种情况下，这一DNA顺序就有利于检出那种微生物体。或者，这个基因可能编码一种某一代谢途径独特的酶，从这样一种序列构建出的基因探针就有可能指示土壤或水样品中一群细菌的潜在活性。这类探针可定义为功能性基因探针。例如，由编码固氮作用的酶的DNA序列可做成基因探针，这样的探针就可以用于测估特定的土壤中是否含有携带固氮基因的细菌。随后，还可以构建另外的探针，用以测定这些机体实际上是根瘤菌属或固氮螺菌属的一些种，或者是蓝细菌。这一基因甚至可能对所有的细菌来说是通用的，因而使检出所有已知细菌成为可能。

1.2利用引物的PCR技术

在分子生态学中，根据扩增的模板、引物序列来源及反应条件的不同可将PCR技术分为以下几种：1）反转录PCR技术（Rt-PCR），是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，可以用来分析不同生长时期的mRNA 表达状况的相关性)。2）竞争PCR（C-PCR），是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。3）扩增的rDNA 限制酶切分析技术（ARDRA），是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术，它依据原核生物rDNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切，然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。4）随机扩增多态性DNA技术（RAPD），是以一个通常为10碱基的寡核苷酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增来鉴别多态性DNA的过程，RAPD分析不需要生物DNA序列，而且DNA用量少，无种族特异性，不需要制备克隆、探针标记和分子杂交等，是一种易推广应用的技术。

1.3DNA序列分析

最充分揭示DNA多样性的方法是DNA序列分析)尤其是荧光标记的核酸自动测序仪的普遍使用，同时随着分子信息学的发展，已有许多功能基因及专门的’DNA序列数据库软件供序列比较，使核基因的序列分析可揭示更高水平多态性)生态学上用的最多的是“通用”引物扩增DNA某些基因（如DNA）的DNA片段，随后用通用引物直接测序)。

1.4电泳分离及显示方法

一般在核酸技术中，都会用到电泳分离方法：琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭染色方法；或聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法。相比之下，后者灵敏度高，每次电泳只要加1～3uL的PCR扩增产物，一次扩增可多次电泳，但操作要比琼脂糖凝胶电泳复杂得多。

1.5生物芯片

近年来，高通量的DNA序列筛选推动了生物芯片技术的发展。生物芯片是指一套DNA探针，通常是从cDNA 或基因组克隆纯化的PCR产物，存放在固体支持物（一般用显微镜载玻片）上，其密度可达每平方厘米几百个点。芯片主要用于基因表达。这项技术已经在制药工业中用于查看药物反应。然而，这项技术的应用看来是无止境的。在环境微生物学中，生物芯片具有一次试验就可筛选饮用给水中几百病原体的潜在能力。

2简述PCR反应的五要素，并说明PCR 实验中该五要素如何选择参加PCR反应的物质主要有五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

①引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

②酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

③dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

④模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase 降解RNA。

⑤Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP 浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

3简述荧光定量PCR的原理及方法，并举一实例说明其应用。原理： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。应用 1. DNA 或RNA 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测, 转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。2. 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异( 如药物处理、物理处理、化学处理等) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证3.

基因分型。例如SNP 检测，甲基化检测等。