过氧化物酶标记链霉亲和素说明书

北京索莱宝科技有限公司

过氧化物酶标记链霉亲和素说明书

HRP-Streptavidin

货号：SE068

规格：0.1ml/1ml

保存：-20℃保存至少一年，避免反复冻融。2-8℃可保存1个月。

产品简介：

链霉亲和素(streptavidin)是与亲和素(avidin)有相似生物学特性的一种蛋白质，是streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66KDa。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10mol/L数量级，这一性质常用于分子生物学用途。其中一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16450。

本HRP标记链霉亲和素是采用进口链霉亲和素和高活性过氧化物酶HRP制成复合物，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学等。

保存体系：0.01M PBS(pH7.4)﹑1%BSA﹑0.03%Proclin300﹑50%甘油。

浓度：链霉亲和素浓度为1mg/ml。

工作效价：

ELISA法：1：500～5000

组织化学：1：50～500

免疫印迹：1：500～5000。

具体效价以产品标签为准，最佳使用条件需根据实际情况而定。

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辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用说明规格：0.1ml/1ml 抗体来源：Goat 克隆类型：Polyclonal 交叉反应：Rb 产品应用：WB=1:1000-10000ELISA=1:1000-10000IHC-P=1:100-1000IHC-F=1:100-1000 not yet tested in other applications. optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user. 分子量：150kDa 性状：Lyophilized or Liquid 浓度：2mg/1ml 免疫原：Full length plasma protein 亚型：IgG 纯化方法：affinity purified by Protein A 储存液：0.01M PBS,pH7.4with10mg/mL BSA and0.1%Gentamicin 保存条件：Storage:Store at–20℃for one year.Avoid repeated freeze/thaw cycles. The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at-20oC.When reconstituted in sterile distilled water or diluent supplied,theantibody is stable for at least two weeks at2-4℃。产品介绍： Immunoglobulin G(IgG),is one of the most abundant proteins in serum with normal levels between8-17mg/mL in adult blood.IgG is important for our defence against

辣根过氧化物酶制作过程

过氧化物酶体与溶酶体不同，过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体，因此它不属于内膜系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2，Hydrogen Peroxide）水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。 HRP的制备 ⒈水提取：称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度，0。 ⒉硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2 小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度）随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析 1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。 ⒊丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃ 的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。 ⒋精制：将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。

生物素标记EMSA探针-AP1

生物素标记EMSA探针－AP1 产品简介：生物素标记EMSA探针－AP1是用于EMSA(也称gel shift)研究的并经生物素(Biotin)标记的AP1 consensus oligonucleotide。这个生物素标记的双链寡核苷酸含有公认的AP1结合位点，可以用作EMSA研究时的探针。 AP1 consensus oligo的序列如下： 5’-CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3’ 3’-GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT-5’ 本生物素标记EMSA探针已经过纯化，可以直接用于EMSA结合反应。本生物素标记EMSA探针可以和碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)配套使用。一个包装的生物素标记探针可以进行约200-400个样品的EMSA检测。保存条件： -20℃保存，一年有效。注意事项：避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。对于基于生物素标记的EMSA检测的详细操作可以参考碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)的使用说明。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明： 1.本生物素标记EMSA探针用于EMSA结合反应时，参考如下步骤进行： A.如下设置EMSA结合反应：阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7-7.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl Super-shift反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 目的蛋白特异抗体 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 样品反应： Nuclease-Free Water 5-5.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的突变探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl

PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使用手册

1PH0728|DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 Catalog No ：PH0728 Size ：?100mL Storage ：Store@-20℃避光保存 ◆产品简介DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA 等膜显色的试剂盒。 DAB 即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB 会产生棕色沉淀。该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB 显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 ◆试剂组分试剂(A):DAB 显色液A---50mL (-20℃避光) 试剂(B):DAB 显色液B---50mL (-20℃避光) 试剂(C):DAB 显色液C---100uL (RT) 自备材料： 1、洗涤液 2、蒸馏水◆使用参考 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 ◆注意事项 1、DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ◆常见问题 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 ④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。 2、没有显色或显色太弱 ①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。 ②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 ③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。

DNA3’端生物素标记

1、准备工作： A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链， 95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。 2、DNA探针的标记： Ultrapure water 29μl TdT Buffer(5X) 10μl 待标记探针(1μM) 5μl Biotin-11-dUTP(5μM) 5μl TdT(10U/μl) 1μl 总体积 50μl A、参考上述设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3、TdT的去除： A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B、12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。 4、探针的纯化(选做)：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作： A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。 B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 E、加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5、生物素标记探针标记效率的检测： A、取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B、取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 C、参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过

PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题

PH0728|DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit Catalog No：PH0728Size：?2×50mL|?2×100mL Store at-20℃ DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。 DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。组分 Component2×50mL2×100mL Storage DAB显色液A50mL100mL-20℃避光 DAB显色液B50mL100mL-20℃ 使用参考 1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 2.按照1:1的比例将显色液A、B液混匀，混匀后即配制成DAB染色工作液。 3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。 4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。注意事项 DAB对人体有害，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展

第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407 辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚 (生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122) 摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一 Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang (Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial 收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12 基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021) 第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.360docs.net/doc/7d3258409.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很

生物素标记试剂盒使用说明书

生物素标记试剂盒使用说明书货号: EBLK0002

产品介绍： Elabscience生物素标记试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂，用于含有氨基（NH2-）抗体的标记。生物素已经活化，可直接使用，每个试剂盒足以完成3次标记，每次可标记0.2-2mg。试剂盒中包括6个用于抗体标记脱盐的Filtration tube，不用透析，操作简便，熟练操作90min可完成整个标记过程。产品特点：试剂全面:本试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂。快速:整个过程仅需90min。方便:通过Filtration tube即可脱盐，无需透析或者凝胶过滤。使用灵活:既可用于微量标记又可大量标记，每次可标记0.2-2mg。理想的标记效果:已经优化确定了最适的标记比例，降低标记不足或由于过度标记而失活的可能性。产品组成：标记过程需要仪器： 1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器 2. 恒温箱（37℃） 3. 离心机（离心力可达到12,000×g）储存条件：本试剂盒未开封前在2-8℃可稳定保存一年

生物素标记反应原理： NH2-Reactive Biotin专一地与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键生物素标记NH 2 -Reactive Biotin使用量的计算：每个反应中生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的量和浓度。通过优化，我们确定了标记2mg/ml的抗体（IgG ，150KD），使用生物素和抗体的分子比为20:1能达到较理想的标记效果。 1、标记2mg/ml的抗体，使用生物素和抗体的分子比为20:1时，应加入生物素量的计算方法： ml蛋白×2mg蛋白 ml蛋白×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 mmol蛋白 = mmol生物素 2、对于10mmol的生物素溶液，应加入反应中该生物素体积的计算方法： mmol生物素×1,000,000μL L ×L 10mmol = ul生物素计算示例：对于0.5ml 2mg/ml的IgG（分子量为150,000）溶液，需加入10mM的生物素溶液13.3ul。 0.5ml IgG×2mgIgG 1mLIgG ×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 1mmolIgG =0.000133mmol生物素 0.000133mmol生物素×1,000,000μl L ×L 10mmol =13.3ul生物素溶液操作过程：实验前准备： 1.仔细阅读使用说明书。 2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。 3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2- Reactive Biotin 继续放置冰箱中）。

34抗体的标记——生物素(Biotin)

抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记一般每个抗体可以标记3～5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。 SOP35 抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记 1. 抗体/蛋白的前处理： 1.1 选择适当截留的超滤柱中加入400μl 标记反应溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg抗体，混匀。 1.2 4℃，6,000rpm，离心2min，弃滤液；于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液，混匀。4℃，6,000rpm，离心2min， 1.3 重复步骤1.2 6～7次。 1.4 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.5 取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.6 步骤1.4 与步骤1.5 的收集的滤液合并，用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml，4℃放置备用。 2. 生物素的标记： 2.1 将生物素溶解在合适的溶剂中（请参照所选购生物素的说明书，不同的生物素其溶剂不同），浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h。 2.2 葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。 2.3 将抗体保存于合适的抗体保存液。进行抗体标记的时候，需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解，否则很难标记出高品质的抗体；标记量低，导致信号值低；标记量太高，不但容易造成背景，并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗，反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多，不同类型的标记物其性质完全不一样，标记物很难选择和把握，建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记，或者直接委托专业化公司标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品，同时可以提供抗体/蛋白标记服务。

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒简介： DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western 、Southern 、Northern 、EMSA 等膜显色的试剂盒。DAB 即3,3N-Diaminobenzidine T ertrahydrochloride, 是辣根过氧化物酶的常用底物。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。组成：操作步骤(仅供参考)： 1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合, 即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。注意事项： 1、 DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。编号名称 PW0072 2×50ml Storage 试剂(A): DAB 显色液A 50ml -20℃ 避光试剂(B): DAB 显色液B 50ml -20℃ 避光试剂(C): DAB 显色液C 100ul RT 使用说明书 1份

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP）一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。简介：过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途： 1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B . 2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。 3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。 4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。实验原理：过氧化物酶催化以下反应： 2 H2O2 ─→ O2+2H2O

生物素标记抗体的免疫荧光方法

生物素标记抗体的免疫荧光方法 *重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。 A.所需溶液和试剂注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。 1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4。 2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。 3.二甲苯 4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。 5.蒸馏水(dH2O) 6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%) 7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。 8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O) 溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。 9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin 注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930) B.样品制备 I.细胞系培养物来源(IF-IC) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。 1.用PBS稍加润洗。 2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。 3.室温下固定细胞15分钟。 4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。 5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。 6.继续C部分的免疫染色。 II.石蜡切片(IF-P) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。脱蜡处理/再水化 1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。 2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。 3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟 4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。抗原暴露：

辣根过氧化物酶标记 Streptavidin

辣根过氧化物酶标记Streptavidin 产品简介：本辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-labeled Streptavidin)也称HRP-Streptavidin、Streptavidin-HRP或辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，为进口分装，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。本HRP-Streptavidin用高纯度的Streptavidin和超纯的辣根过氧化物酶交联而成，确保产生最低的本底和最高的灵敏度。本产品的浓度为1mg/ml。 Streptavidin的分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。Streptavidin和生物素的亲和常数为K d=10-15M。 Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii 中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI= ~10.5，在中性pH条件下呈碱性。由于Streptavidin 和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase (HRP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot 检测时催化DAB产生棕色沉淀。本辣根过氧化物酶标记Streptavidin用于各种常规用途的推荐稀释比例参考下表，实际实验操作过程中需根据具体情况适当调节辣根过氧化物酶标记Streptavidin的稀释比例。对于Western，推荐的稀释范围为1:2000-10000。本产品如果用于常规的Western检测，以每次检测需10毫升1:2000稀释的本产品计，可以检测40次。保存条件： -20℃保存，一年有效。注意事项：叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的溶液中不可加入叠氮钠。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明： 1.Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等请参考相关实验步骤进行。起始稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。使用本产品的文献： 1. Liu H, Jiang C, Xiong C, Ruan J. DEDC, a new flavonoid induces apoptosis via a ROS-dependent mechanism in humanneuroblastoma SH-SY5Y cells. Toxicol In Vitro. 2012 Feb;26(1):16-23. 2. Liu J, Qian X, Chen Z, Xu X, Gao F, Zhang S, Zhang R, Qi J, Gao GF, Yan J. Crystal structure of cell adhesion molecule nectin-2/CD112 and its binding to immune receptorDNAM-1/CD226. J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5511-20. 3.P Xiao, X Lv. Immobilization of Chymotrypsin on Silica Beads Based on High Affinity and Specificity Aptamer and Its Applications.

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex

G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效

辣根过氧化物酶的色原底物

辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2， 2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。 (一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol ／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。 TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。