真空冷冻干燥法保藏菌种
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
整理微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
精品文档国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二00四年十二月十日精品文档目次前言 (2)弓I 言 (3)1范围 (4)2规范性引用文件 (4)3术语和定义 (4)4内容 (5)参考文献 (10)精品文档*»-t-刖言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
精品文档精品文档引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
精品文档精品文档微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
食用菌菌种贮藏八法
食用菌菌种贮藏八法1.低温定期移植贮藏法将需要贮藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3℃-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中贮藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。
贮藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。
因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。
除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法贮藏。
2.液体石蜡贮藏法取化学纯液体石蜡(要求不含水分、不霉变)装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40℃恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。
将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，在28℃-30℃温度下培养2-3天，确定无杂菌生长方可使用。
然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待贮藏的斜面试管中。
注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米为宜，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处贮藏。
贮藏时间在1年以上，在低温下，保藏时间还可延长。
3.沙土管贮藏法取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至pH值达到中性，烘干备用。
同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使其呈中性，沉淀后除去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以(2-4)：1比例混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌(1.5公斤/平方厘米，1小时)，再干热灭菌(160℃，2-3小时)1-2次，进行无菌检验，合格后使用。
将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌薹，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入沙土管中，以浸透沙土为止。
将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。
真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。
菌种冷冻保藏
7.4采用酒精喷灯进行封管时，烧的温度要适宜。封管后不要立即放在台面上，以防受冷撕裂。
附图：泪滴型安瓿管长颈毛细玻璃管
多头岐管
附：1、冷冻保藏改进方法（一）
因真空冷冻干燥器价格比较昂贵，通常抗生素生产厂都采用自制的简单易行办法，可达到同样的目的。即：
6.2制备脱脂乳
取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮、油脂，吸取下层奶液，经脱脂棉过滤，如此反复3次脱去脂肪，然后分装入两个250 ml三角瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在115℃25min高压蒸汽灭菌，冷却后做无菌试验，4℃冰箱保存备用。
6.6预冻
因为迅速超低温预冻可保持菌体细胞结构成份原状，利于细菌存活。故将分装好的冷冻管及指示管置于低温冰箱冷冻室-70℃下快速冷冻过夜。无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。也可用液氮。将冷冻管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。也可用液氮预冻。还可用低温冰箱-80℃预冻1～2小时后转入冷冻真空干燥。
由于同时满足菌种保藏三要素，使微生物始终处在低温、干燥、缺氧的条件下，能克服传代、沙土管简单保藏方法的不足，保藏菌种范围广、时间长（保藏期可达数年至十数年）、存活率高、保存过程不易失活和退化等。
3、主要步骤为：
3.1将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中；
3.2在低温（-45℃以下）下使微生物细胞快速冷冻；
6.7冷冻真空干燥
真空冷冻干燥器有成套的装置出售（长药厂新近成立菌种中心，购有该机）。按其方法操作。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上，再根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。将预冻好的冷冻管及指示管于次日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机的干燥箱内，开动真空泵进行一级真空抽干，待指示管出现由粉红色变全兰色时，再进行二级抽干12h。二级真空干燥既保持菌体细胞干燥度，又避免细胞反复冻结造成保存中菌体死亡，因而能更长期保存菌种，并能提高其存活率，又不会发生菌株的变异
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
菌种保存方法
菌种保存方法菌种保存是微生物学研究中非常重要的一环，它可以保证菌种的长期保存和稳定性，为科研工作提供了可靠的保障。
下面将介绍几种常见的菌种保存方法。
首先，冷冻保存是最常见的菌种保存方法之一。
冷冻保存是指将培养好的菌种悬浮液或培养物在-80℃以下的低温条件下保存。
在保存前，需要将菌种悬浮液加入一定比例的保护剂，如甘油或DMSO，以增加菌种的冷冻耐受性。
冷冻保存不仅简单易行，而且保存时间长，可以保存数年甚至更长时间。
其次，干燥保存也是一种常用的菌种保存方法。
干燥保存是指将培养好的菌种用干燥剂或者真空干燥的方法将菌种完全脱水，然后保存在低温、低湿的条件下。
这种方法保存的菌种可以在常温条件下保存，并且保存时间也相对较长。
另外，液氮保存也是一种非常有效的菌种保存方法。
液氮保存是指将培养好的菌种悬浮液或培养物直接存放在液氮罐中保存。
由于液氮的温度极低，可以有效地阻止微生物的代谢和生长，因此保存效果非常好。
但是在使用液氮保存时需要注意安全问题，操作人员要具备相关的安全知识和技能。
最后，冷冻干燥保存也是一种常见的菌种保存方法。
冷冻干燥保存是将培养好的菌种在低温条件下冷冻，然后通过真空干燥的方法将菌种脱水保存。
这种方法既兼具冷冻保存和干燥保存的优点，保存效果非常好，被广泛应用于微生物学研究中。
综上所述，菌种保存方法有很多种，选择合适的保存方法需要根据具体的实验要求和条件来确定。
无论采用何种保存方法，都需要严格按照操作规程来进行，以确保菌种的保存质量和稳定性。
希望本文介绍的菌种保存方法对大家有所帮助。
菌种保藏方法
一、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。
保藏温度要求在-4～4℃下。
液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。
具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。
二、甘油管冷冻保藏法1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。
其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。
将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。
取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。
-20℃保存时间较短。
或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。
2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。
甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。
三、真空冷冻干燥法1．试验原理真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。
冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。
为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
最新微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
1.1.1.1.1.2微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二〇〇四年十二月十日目次目次 (1)前言 (2)引言 (3)1 范围 (4)2 规范性引用文件 (4)3 术语和定义 (4)4 内容 (5)参考文献 (10)前言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1 范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489 实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3 术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥 freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
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真空冷冻干燥法保藏菌种
操作过程
1、安瓿管准备
选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。
2保护剂的选择和准备
选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂， 115℃下高压蒸汽灭菌25min，备用。
3冻干样品的准备
(3)菌种准备及分装
菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。
每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。
如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到108～1010个/ml为宜。
悬液制备完成尽快分装和冻结。
分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约0.1～0.2毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌条件下操作。
4预冻
-80℃冰箱预冻1～2小时。
5冷冻干燥
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
终止干燥时间应根据下列情况判断：①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。
6真空封口
将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。
7保藏
安瓿管保藏在-20℃冰箱里。
8活化
如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的
安瓿管的顶端，使管子破裂，在安瓿管中加入0.5～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，是冻干菌种复水，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。