人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)标准操作规程
《中国药典》2020版—人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)
剂分装后，对留样进行无菌检
防腐剂分装后，对留样进行微生物
查，采用直接接种法，应符合规
限度检查，需氧菌总数应不高于
定。
102cfu/ml, 霉菌和酵母菌总数应不
高于10 cfu/ml。
1
附件 2：人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试盒（酶联免疫法）
品种名称
原公示稿内容（2019年5月）
拟修订内容
人类免疫缺陷病
3.1.3 无菌检查
3.1.3 微生物限度检查
毒抗原抗体诊断
依法检查（通则1101）含有蛋白
依法检查（通则1105 通则1106）含
试剂盒（酶联免
成分的液体组分，半成品加防腐
有蛋白成分的液体组分，半成品加
人类免疫陷病毒(HIV)1+2型抗体(酶联免疫法)标准操作程序SOP文件
3．分别在每孔加入酶标记抗原100ul ,轻拍混匀，封口胶封好，置于37 C温育60分钟。
4．用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完毕后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。
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[结果判断]
1,阴阳性对照和被检样本的OD值减去空白对照OD值即为计算值.
2,若阴性对照OD均值小于0.02按0.02计算.
3,临界值(cut off值)的设定:
cut off值=阳性对照均值X 0.10+阴性对照OD均值
4,被检样本的D值>=临界值应判为HIV抗体阳性反应,<临界值为阴性反应.
[试剂厂家]
华美生物工程公司
[试剂组成]
1．HIV微孔板4．HIV阴阳对照
2．HIV酶标抗原5.底物液A.B
3．浓缩洗涤液6.终止液
[试剂的稳定性与贮存]
试剂自生产日起避光贮存于2-8℃,有效期内（六个月）稳定。
[标本的收集与处理]
标本为新鲜无溶血血清或血浆。
[操作步骤]
1．取出试剂盒平衡至室温，将浓缩洗涤液用蒸溜水或去离子水按1：19稀释后备用。
待测样本的OD值>=临界值判为HIV抗体阳性,应重新取样双孔复试,复试阳性者应按照"全国HIV检测管理规范"送"HIV确认实验室"进行确认实验.
[质量控制]
为确保测试结果准确可靠，每批测试均应放置阳性质控血清与被检样品同时测试，用以检查试剂性能。
[临床意义]
人体受到免疫缺损病毒（HIV）感染后，试验呈阳性反应，如男性同性恋、静脉药瘾者（吸毒者）、血友病患者、艾滋病人的配偶。个别献血员中也有阳性反应的报告。
酶联免疫试剂盒实验操作规程及注意事项
操作规程：溶液配制1、针对呋喃唑酮、呋喃它酮、氯霉素等试剂盒，他们的1X洗液、1X样品稀释液、终止液是通用的。
检测数量大的情况下可以大量配制洗液、样品稀释液等，一般建议一个礼拜重配一次。
2、可以或需要前处理前配制的溶液：呋喃类：缓冲溶液、样品稀释液、1M HCL、1M NaOH、10mM邻硝基苯甲醛、洗涤工作液氯霉素：样品稀释液、洗涤工作液3、检测时配制的溶液：呋喃类：A、B液需在洗板前配制好，并混合均匀。
氯霉素：酶结合物工作液、A B液样本处理呋喃类：1、1g组织样本+4ml水+0.5ml 1M HCL+400ul 10nM邻硝基苯甲醛，剧烈涡动1min；2、60℃温箱孵育1h，然后拿出来涡动30s，继续孵育0.5h；3、依次加入5ml缓冲溶液、400ul 1M NaOH、6ml乙酸乙酯；4、剧烈涡动1min后4000g离心10min；5、取3ml上清液50-60℃氮气吹干，加入2ml正己烷，再加入1ml样品稀释液，高速涡动30s；6、4000g以上，离心5min，去上层及中间层杂质，取下层液体待测。
氯霉素：1、3g样品+ 6 mL 乙酸乙酯，充分涡动1 min后4000 g 离心 10 min；2、取 4 mL 上层乙酸乙酯50-60℃氮气吹干，加入2 mL正己烷，充分涡动10 s，再加入 1 mL 样品稀释液，低速涡动 1 min；3、4000 g 以上，离心 5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50 µL 进行检测。
检测过程呋喃唑酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶标二抗+50ul抗体工作液后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。
呋喃它酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶结合物后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。
人类免疫缺陷病毒抗体检测规程
人类免疫缺陷病毒抗体检测规程一、操作步骤：1、将试剂盒从冰箱中取出，至室温中平衡30分钟后使用。
2、将标本对应微孔按顺序编号。
3、配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释至1000ml备用。
4、编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照一型、二型各一孔，空白对照一孔。
5、加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100ul。
6、温育：覆盖黏胶纸，置37度孵育30分钟。
7、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，吸干板内液体，将洗涤液注满各孔（约300微升/孔），吸干，反复5次，在干净纱布上将板拍干。
8、每孔加酶结合物100微升，取新粘胶纸覆盖放映板，置37度孵育30分钟。
9、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，吸干板内液体，将洗涤液注满各孔（约300微升/孔），吸干，反复5次，在干净纱布上将板拍干。
10、每孔加入底物缓冲液50微升，TMB50微升，混匀，置37度显色10分钟。
11、加终止液50微升震荡反应板5秒钟，使之充分混匀。
12、在酶标度数仪上，取波长450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长630nm），仪空白对照孔校零，读取每孔吸收值（加终止液后，务必在15分钟内读数完毕）二、结果判断：抗HIV阳性对照OD值大于0.8，抗HIV阴性对照OD值小于0.08。
Cutoff Value=阳性对照值乘以10%（若阳性对照OD值大于2.5按2.5计算）标本OD值小于等于Cutoff Value为阴性。
标本OD值大于Cutoff Value为阳性。
三、注意事项：1、在试剂的使用单位必须使当地卫生行政部门标准的HIV初筛试验室。
2、整个检测工作必须符合HIV试验室管理范围和生物安全守则规定，严格防止交叉感染。
操作时必须带手套，穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。
3、HIV检测结果的判定不许以酶标仪的读数为准。
4、标本和酶结合物均应用加样器加注，并经常校对其准确性。
人类免疫缺陷病毒抗体的操作流程
人类免疫缺陷病毒抗体的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）是导致人类获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome AIDS）的病原体。
HIV通过血液传播、性传播和母婴传播三种途径在人群中流行和扩散。
1981年美国报道第一例艾滋病病例，至2009年年底，全球有存活的HIV感染者大约3330万例。
我国1985年报告第一例艾滋病传入病例，截止2009年12月，估计有存活的HIV感染者74万人。
HIV进入人体以后，感染和破坏人体的CD4+T淋巴细胞，快速复制繁殖，病毒数量迅速增加。
在感染的初期，病毒载量的水平很高，传染的危险大，急性期以后，病毒载量下降到相对稳定的定点（Set point）水平，在长达5～10年的临床潜伏期内，病毒载量和CD4+T淋巴细胞数量都保持相对稳定，这实际上是一种动态平衡，身体内每天有上亿个病毒被清除，也有相同数量的病毒产生，同样也有大约上亿个CD4+T淋巴细胞被破坏，有相同数量的细胞再生。
到了病程晚期，免疫细胞被耗竭，病毒大量复制，病毒载量升高，免疫功能崩溃，病人因发生各种机会性感染或肿瘤而死亡。
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒是艾滋病防治的有力工具，广泛应用于献血员筛选、临床诊断和流行病学调查。
1985年3月美国FDA批准了第一种人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒，这是艾滋病防治进程中重要的里程碑、开启了科学防治艾滋病的时代。
一、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus HIV）HIV在分类上属于逆转录病毒科、慢病毒属、灵长类慢病毒群。
病毒呈球形颗粒，被来自宿主细胞膜的脂质双层膜包裹，基因组结构大致是5’LTR，gag，pro，pol，env，3’LTR，5’端有帽状（cap）结构，3’端有多聚腺苷酸Poly (A) 序列，如果去掉Poly (A)，基因组全长9100bp。
人类免疫缺陷病毒(HIV 1+2)抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)
人类免疫缺陷病毒（HIV 1+2）抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）说明书批准文号：国药准字S2*******本品系用HIV特异性抗原gp160和gp36等包被酶标反应板，用gp160和gp36标记辣根过氧化物酶，应用双抗原夹心法原理（ELISA）检测人血清或血浆中的HIV-1/HIV-2抗体。
【样本要求】人血清和血浆。
【使用方法】1、每次试验设阴性、阳性对照各两孔，分别加入阴性、阳性对照血清100μl，再设一孔空白对照，其余孔加入100μl被测样本，置37℃孵育30分钟。
弃去孔内样本，扣干。
2、用洗涤液注满每孔（至少300μl洗涤液/孔），勿溢出，静置5秒钟后扣干，重复5次。
3、每孔加酶结合物100μl（空白对照孔不加），置37℃孵育30分钟，同上法洗反应板5次。
4、每孔加显色剂A液、B液各50μl，轻轻振荡后，37℃避光静置15分钟。
5、每孔加入终止液50μl终止反应，以空白调零，在酶标仪中读取各孔OD450。
【结果判定】1、 实验设计要求阳性对照平均值大于1.20，阴性对照平均值小于0.10，阳性、阴性对照OD值之差应大于1.20，否则本次实验无效。
2、 若阴性对照读数小于0.05时，按0.05计算。
3、 临界值（Cut off value）=阴性对照平均值+0.10。
4、 测试样本的计算值小于Cut off value则为HIV抗体阴性。
5、 测试样本的计算值等于或大于Cut off value则为HIV抗体阳性。
（注意：初试阳性标本应重新取样进行双孔复试，复试阳性者应按“全国艾滋病检测管理规范”送HIV确认实验室进行确认实验）。
【注意事项】1、 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。
2、 整个HIV检测必须符合《HIV实验管理规范和生物安全守则规定》，严格防止交叉感染。
操作时必须戴手套、穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度。
3、 HIV抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。
HIV抗体检测的标准操作程序（ELISA法和快速法）
HIV测定（ELISA法）标准操作规程1、检验目的应用双抗原夹心酶联免疫法原理（ELISA）定性检测人血清、血浆标本中的HIV（1+2）型抗体的测定，用于HIV感染的辅助诊断，抗HIV药物治疗的效果的监测。
2、原理采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV （1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。
通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。
3、性能参数灵敏度高（0.5ng/ml）4、标本要求（1）标本类型：血清，血浆。
（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，2-8℃不超过72小时，-20℃可长期保存，应避免反复冻融（4）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
本文来自检验地带网5、容器和添加剂类型6、试剂（1）试剂名称：人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒。
（2）试剂生产厂家：上海科华生物工程股份有限公司（3）包装规格：96T/Kit（4）试剂盒组成：①、HIV酶标板；②、HIV酶标试剂；③、HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；④、显色剂A液和B液；⑤、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。
7、仪器设备：酶标仪：ZS板式，北京普朗生物技术有限公司，每年由计量单位进行一次校准。
洗板机：DNM-9620型，北京普朗生物技术有限公司，每年由国家计量单位进行一次校准。
移液器：上海求精，每年由国家计量单位进行一次校准。
8、校准程序9、操作步骤①、配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。
②、编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。
③、加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl，用封板膜封板后置37℃温育60min。
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1、检验申请
单独检验项目申请：人类免疫缺陷病毒抗体{缩写抗HIV（1+2）]测定。
临床医生根据需要提出检验申请。
2、标本采集与处理
2.1标本采集
2.1.1常规静脉采血约2ml，不抗凝，置普通试管中，或采用含分离胶的真空
采血管。
也可采集血浆，用肝素、EDTA或枸橼酸盐抗凝。
2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。
2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。
2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。
专人负责标本的接收
并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2.1.5下列标本为不合格标本
2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。
2.1.5.2对检测结果可能有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。
2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。
2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。
2.2标本保存
2.2.1接收标本后在置1-2h后将标本离心分离出血清或血浆，避免溶血。
离
心必须达到3000rpm 15min，离心后的血清中不能含有颗粒物和微量纤维蛋白。
2.2.2标本保存时间：室温（15-25℃）下可稳定48h，普通冰箱中（2-8℃）
稳定7d，在-20℃最多可保存4周。
避免反复冻融。
不可使用热灭活的标本。
2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4-8℃冰箱内保存7d。
2.3标本采集的注意事项
采血前使受检者保持平静、松弛，避免剧烈活动。
3．方法原理
本实验采用HIV特异性抗原gp160和gp36等包被微孔反应板，用gp36、gp41标记辣根过氧化物酶。
当待测标本中存在HIV抗体时，该抗体和固化的抗原结合于反应板上，并进一步与酶结合物相结合，在TMB底物参与反应的情况下，产生显色反应。
4．试剂及其他用品
4.1试剂：人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒，由上海科华生物工程股份有限公司出品，试剂盒药品批准文号：国药准字S2*******(96人份)。
未打开的试剂盒保存于2-8℃，不可冻存。
开启的包被反应板放入干燥剂密封后在2-8℃保存并尽快使用。
未打开的试剂盒保存于2-8℃，不可冻存。
微孔反应板打开包装后，应立即将未试用的板条装入有干燥剂的自封袋中密封，置2-8℃避光保存。
未使用完的酶结合物、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色剂A、显色剂B和终止液，在没有其他试剂污染的情况下，保存于原试剂瓶，并拧紧瓶盖，置2-8℃中避光保存，可使用至标签标识有效期。
4.2试剂盒组分
微孔反应板抗-HIV阴性对照
抗-HIV-1阳性对照抗-HIV-2阳性对照
酶结合物显色剂A
显色剂B 终止液
洗涤液（蒸馏水1：25稀释）封片
说明书
4.3其他试剂及用品
加液器：型号。
离心机：型号。
温箱（或水浴箱）：型号。
洗板机：型号。
酶标仪：型号。
5．室内质控与室内质控规则
5.1质控品：采用卫生部临床检验中心临床免疫室免疫质控血清，浓度
NCU/ml。
5.2质控品重建方法：采购来的质控品按每周用量分装-20℃冻存，复融后充分颠倒混匀。
5.3质控品测定：在每一次（板）标本中测定质控血清。
5.4质控规则：绘制质控图，求出SD和CV值。
6．标本检测步骤
（1）洗涤液配制：将浓缩洗涤液用蒸馏水（或去离子水）作1：25稀释。
（2）加样：
每次实验设抗-HIV-1阳性对照孔2孔（每孔100µl），设抗-HIV-2阳性对照孔1孔（100µl）抗-HIV阴性对照孔1孔（100µl）。
建议预
留空白对照1孔（不加样本和酶结合物，只加底物和终止液）。
剩余各
孔加待测样本100 µl。
用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育
60分钟。
（3）洗板：
手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30-60秒，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸是上拍干。
洗板机洗板：采用洗板机洗板，选择洗涤5次程序，用配置的
工作浓度洗涤液注满每孔，每次工作浓度洗涤液在反应微孔
中的停留时间为30-60秒，并确保每次吸净无残留，洗完
后在干净的吸水纸上拍干。
（4）在已加入待测样本和阴、阳性对照的孔中加入100μl酶结合物。
混匀，用封片纸覆盖反应板，置37℃孵育30分钟。
（5）洗板：洗板步骤同步骤（3）
（6）显色：
洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A、显色剂B各50μl，混匀。
用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30分钟。
（7）终止：
在所有孔内加入50μl终止液，振荡反应板5秒钟，使之充分混匀。
（8）比色：
使用酶标仪，取波长450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长630nm或630nm相近的波长），若需扣除显色剂空
白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。
（加终止
液后，务必在10分钟内读数）。
7．结果判断：
Cutoff值计算：COV＝抗-HIV-1阳性对照平均OD值×10%
（若阳性对照OD值>2.5按2.5算）
当S≥COV时，说明该检测样本抗-HIV反应呈阳性。
当S＜COV时，说明该检测样本抗-HIV反应呈阴性。
8．检验结果的报告及范围
8.1结果的报告
8.1.1结果经审核后，确认准确无误后发出报告。
8.1.2报告单上标明结果的参考区间、报告日期、时间、操作者和审核者签名，
并有与申请单相同的信息。
8.1.3如收到标本的质量可能对测定结果有影响的也在报告单上指出。
8.2 临界值：对于处于阳性判断值边缘即稍低于cutoff的样本，难以判断是
否为感染早期，或实际为非感染者的标本，此时，可以再次取血测定和（或）用另一种ELISA试剂盒检测，从而明确测定结果。
这种情况下，如果测定结果仍处于cutoff边缘，则建议数月后再次测定，如仍无改变，则说明无HIV感染。
9．操作性能
9.1从冷藏环境中取出的试剂盒需平衡至室温后方可使用，余者应按前述方法
保存和使用。
在平衡试剂的同时，待测样本需平衡至室温后再行测试。
9.2 使用前试剂应摇匀。
9.3 显色过程必须封片。
所有封片纸不能重复使用。
9.4 结果判断须在反应终止后10分钟内完成。
9.5 不同批号的试剂不可混用。
9.6洗板机洗板时应时常检查加液头，确保其畅通无堵塞；洗板时所用的吸
水纸请勿反复使用。
洗板机的管路用纯化水冲洗，以防堵塞和腐蚀。
9.7 样本和酶结合物均应用微量移液器加注，并经常校对微量移液器准确性。
9.8 HIV检测结果的判定必须以酶标仪的读数为准。
9.9 本试剂的使用单位必须是当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。
9.10 本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
整个
检测工作必须符合HIV实验室管理规范和生物安全守则规定，严格防止
交叉感染。
操作时必须戴手套，穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制
度。
10．参考范围及医学决定水平
阴性结果：提示没有检测到人类免疫缺陷病毒抗体。
11．临床意义
适用于献血员及高危人群中人类免疫缺陷病毒抗体的筛查。
12．结果审核以及分析与相关项目的联系
12.1由资深专业人员负责检验结果的审核。
12.2审核者认真审核每一个测定结果，对发出报告结果的可靠性负责，并
在报告单的审核者处签字。
12.3阳性者须取样双孔复试，复试阳性者应按全国HIV管理规范送HIV确
认实验室进行确认实验。
13．参考文献
13.1 体外诊断试剂说明书编写指导原则（国食药监械[2007]240号）。
13.2《中华人民共和国药典》2010年版三部。