酶联免疫吸附试验的影响因素
影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法
影响酶联免疫吸附试验结果的常见因素及控制方法摘要】酶联免疫吸附试验是免疫酶技术中固相酶免疫测定的一种技术。
ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但是操作中的各个环节对试验的检测结果影响较大，如不注意排除干扰因素，有可能导致显色不全、花板等现象。
现将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
【关键词】酶联吸附试验影响因素【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）09-0369-021 试剂的因素1.1 试剂的选择试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。
虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，但不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。
更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。
因此。
选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
1.2 试剂的准备在临床实验室，对试剂的准备一般不太注意，通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因此，在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
2 样本的因素2.1 标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。
2.2 标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶，可使实验出现非特异性显色。
因此，ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能当时测定，5 d之内应4℃保存，1周后检测应低温冻存；同时，收集标本采用无菌试管，可防止标本的污染。
酶联免疫吸附试验中常见问题的产生原因及解决办法
２ ． ３ 实验 室环境温度控制 实验室温度过高或者
过低 都会 使 吸光值 偏差 。试 剂盒 使用 前后 没有 达到 规 定温 度 、 孵 育和 避光 显色温 度 时 间不达标 ， 实验 室 避 光条 件不 具备 ， 都会 导致 试验 误差 。
３ ． ３ 实验 室环境温度控制 良好
３ ５ ３ ０ ０ ０
用 酶标 记物 进行 免疫 学检 测 的方法称 为酶 联 免 疫 吸 附试 验 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ） 。该技 术 诞 生于 ２ ０世 纪 ７ ０年 代初 ， 可进 行 定 性 或定 量 分 析 ， 主要有间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ、 阻断 Ｅ ＵＳ Ａ、 双 抗 体夹 心 Ｅ ｕＳ Ａ三 种 方法 。 目前 该 技术 在 猪瘟 、 口蹄 疫 、 高 致病 性 猪 蓝耳 病 、 猪 伪 狂 犬 病、 猪 乙型脑 炎 、 猪链 球 菌病 、 猪 圆环病 毒病 、 猪传 染
不规 范 的操作 环节 都会 对试 验结 果产 生影 响 ，出现
错 误 的结果 。 １ 常 见 问题
操作， 要 求血 清清 亮 、 无溶血， 避 免 使用 严 重 溶 血 的 血 清样 品 。 当血清 中有 凝块 时 ， 要 特 别小心 不 要吸 到 任 何凝 结 的材料 或者 血球 。被检 血清 保存 时 间不 能 太久 ， 冻 结 血清 解 冻后 ， 应 该 充 分混 匀 ， 稀 释 后 的血 清 样 品在添 加到 包被 板之 前也 要混 合均匀 。解冻 后 血清标 本争 取一 次性 检测 完成 ，血清 标本 如 需保 存 作多 次检 测 ， 宜 少量 分装 冷 冻保 存 。
检 测板 吸光 值偏 高及 出现假 阳性 ；检 测板 吸光 值 偏 低 及 出现 假 阴 性 ； Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检 测 板 避 光 显 色 后颜
酶联免疫吸附试验(ELISA)测定错误结果的原因分析
ELISA测定错误结果的原因分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。
ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：1．内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。
常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施
影响酶联免疫吸附试验检测结果的原因分析及应对措施酶联免疫（EliSA）是检验科目前常用的免疫学检测方法之一，其操作方便、简单，不须要特殊设备，使其在各级医院都可应用。
但如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性的结果。
因此了解影响结果的因素，是减少差错事故发生很必要的。
1实验室操作人员的基本素质因素实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。
因为我们是为人服务的，所以我们的职业道德水平直接关系到人们的生命健康和生命安全。
如果在工作中出现了张冠李戴，就有可能造成严重后果。
其次文化素质和技术素质很重要，我们必须熟练掌握本专业的基本理论和操作技术。
还要不断努力学习新的理论知识，努力提高业务水平。
有良好的心理素质勇于面对工作中的挫折，在繁忙工作中有条不紊。
所以人员素质问题对检验结果有重要的影响因素。
2标本处理因素实验室人员收到标本后应：“三查七对”，对不符合要求的标本和申请单拒收，合格标本及时分离血清，避免溶血。
提取血清时不能混有大量纤维蛋白或细胞成分，对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录。
从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，充分混匀再用。
3操作过程的影响因素3.1 操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度（保持在18～25℃），反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，各种条件必须符合要求。
3.2 正确使用加样器，加样器应垂直加入标本或试剂，避免摩擦包被板底部。
加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要一次性使用，加样次序要与说明书一致，否则易发生错误，造成实验重复性差。
3.3 手工洗板加洗液时冲击力不能太大，洗涤次数不超过说明推荐的次数，洗涤液在反应孔内滞留的时间不宜太长。
不要让洗液造成孔间污染，导致假阴性和假阳性。
3.4 要保证加液量一致，我们在使用时感觉加样器比滴瓶加样准确，滴瓶加液量不准造成显色不一，造成判断错误。
酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒影响因素分析
ＨＢ Ａ ｓ ｇ标准 品 由卫 生部 临检 中心 提供 ， 号 １ ０ ； ｓ 批 １ １ＨＢ Ａｇ Ｅ ＩＡ试 剂 盒 由上 海 华 泰 生物 工 程 实业 有 限 公 司提 供 ， 号 ＬＳ 批 ２ １０ ０ １ ０ １ ３ １ ：检 测 仪 器 使 用 Ｂｏ ｅ － Ｌ ０洗 板 机 、 ｉＴ ｋ— ｉ ｋ Ｅ Ｘ５ Ｔ Ｂｏｅ Ｅ ０ Ｉ ０酶标 仪 。 Ｘ８
１３ 方 法 ．
参照 《 国临床 检 验 操 作规 程 ＞ Ｌ Ｓ 双抗 夹 心 法 ， 法 全 ＞ ＩＡ Ｅ 本
主要用 于检测 大分 子抗 原 。 加抗 体包 被一 ４Ｃ ￣过夜 ， 洗涤 ３次 、 抛 ｆ ； 待 检抗 原 一 ３ ｃ ０ｒｉ 洗 涤 ３次 、 干 ； 酶标 抗 加 ７ｃ ３ ｎ， ａ 抛 加 体一 ３ ℃ ３ ｉ ， 涤 ３次 、 十 ； 底 物液一 ３ ℃ １ ｎ 加 ７ ０ｍ ｎ 洗 抛 加 ７ ５ｍｉ ，
酶联 免疫 吸附试 验 （ Ｌ Ｓ 是一 种 常用 的 固相 酶 免疫 测 Ｅ ＩＡ） 定 方 法 ， 在 临 床 检 测 时 其 影 响 因 素 也较 多 ， 者 以 Ｅ ＩＡ 但 笔 ＬＳ 检 测 ＨＢ Ａ ｓ ｇ为例 ， 讨 该试 验 的影 响 因素 ， 探 报道 如 下 ：
１ 资 料 与 方 法
以２
ＬＨＢ Ａｇ 准 品作 样 品 ，采 用 微 波 ９ 、７Ｃ ｓ 标 ０Ｓ ３ ￣ ￣
箱 ｌｈ两 种 不 同 温 育 法 检 测 ＨＢ Ａ 。 将 中 央 孔 和 周 围 孔 （６ ｓｇ ９
血 ． 血会 导致 非 特异 性 显色 而 出现假 阳性旧 溶 。③ 温 育 ： 如果
酶 标 板 周 围 与 中 间 升 降 速 率 不 同 ， 致 中 央 孔 与周 围 孔 吸 光 导
酶联免疫吸附试验检测的影响因素分析
酶联免疫吸附试验检测的影响因素分析发表时间：2014-05-13T09:24:22.107Z 来源：《中外健康文摘》2013年第41期供稿作者：钱瑞[导读] 因其操作简单，灵敏度高，特异性好，经济安全，不需要特殊设备等特点而在临床上广泛应用。
钱瑞（山丹县人民医院 734100) 【摘要】目的通过对酶联免疫吸附试验检测的影响因素分析，探讨各因素对结果的影响，以便寻找解决的方法和加强质量控制，从而保证检测结果的准确性和精确性。
【关键词】酶联免疫吸附试验影响因素分析【中图分类号】R446.61 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）41-0059-02 酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测生物标本中微量的特异性抗体或抗原的临床检验方法，而且其反应中各组分的成本较为底廉，特别是对肝炎病毒的检测，最基层的医院也能开展。
因其操作简单，灵敏度高，特异性好，经济安全，不需要特殊设备等特点而在临床上广泛应用。
为辅助临床诊断与生物科研起到了积极的推动作用。
在从事检验工作多年中深知ELISA测定中影响因素较多，由于其操作步骤复杂，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，甚至出现错误的结果，因此，必须加强ELISA检测的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。
现将影响因素做以分析。
1 材料1.1试剂的准备目各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。
应选择质量优良、有批准文号且在有效期内的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作。
从冰箱中取出的试剂应放在室温下或37℃平衡30分钟再进行测试。
保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并做好记录，冰箱应避免频繁开关,试剂使用前应摇匀。
1.2标本的准备酶联免疫吸附实验中标本的质量也是影响结果的关键因素之一，标本的干扰物质容易引起假阳性或假阴性的结果。
1.2.1严格执行样本的查对制度，接受标本应将标本上的标签与申请单逐一核对，验收签字。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
成污染或效价降低 ， 可引起假 阴性 ， 因此应尽量 用新鲜标本 。 冰
冻标本应避免反 复冻融 ， 因冰冻标本 的反 复冻融产生的机械力
查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题，
与试剂商联 系更换新 的批号试 剂后 ， 此现象 消失 。
对标本中的蛋白分子有破坏作用 ， 可引起假 阴性鹳 。
箱 中取 出， 检测 时试剂盒可与室温平衡。 ２ 标本因素
吸附试验 。该试验用 已知抗原检测未知抗体 ， 或用 已知抗 体检
测未知抗原 ， 虽 然操作 简便 ， 但影响 因素诸多 ， 一个环节出现问 题， 都可能会导致检 测的失败 。现将 酶联免疫吸附试验常见影 响因素及处理方法总结如下。
酶联免疫 吸附试验 的常见影 响因素及处理方法
董 文婷
（ 夏县人民医院 ， 山西 夏县 Ｏ ４ ４ ４ Ｏ ０ ）
临床免疫室开展的乙肝系列 、 丙肝抗体 、 艾滋病抗体 、 梅毒
特异性检测等 日常检测工作 ， 最 为常用 的检测方法 为酶联免疫
疫 吸附试验 中， 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前 与室温 平衡 ， 以满足检测要 求 ， 一 般检测前 ３ ０ ｍ ｉ ｎ即应将试剂盒从 冰
的质量 ， 试剂盒从 出厂到用户手 中 ， 均要历 经运输 （ 如送检 、 检
定、 发货等 ） 及运输 中的储存 环节 ， 某一环节 不当 ， 均影 响试 剂 盒 的临床使 用质量 。去年 我科有一段 时间所做 的表面抗 原项
目， 今天阳性 ， 同一份标本 明天复检有可能是弱 阳性甚 至阴性 ，
结 果 比 较 ｑ值 分 别 为 １ ． ９ ７ ， ２ ． ０ ４和 １ ． １ ２ ， Ｐ均 ＞ ０ ． Ｏ ５ 。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。
然而，在进行ELISA实验时，存在许多可能影响实验结果的因素。
本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。
1.样品质量：样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。
如果样品质量不合格，可能会导致错误的实验结果。
处理方法包括：-选择合适的样品储存条件，避免样品的变性、降解等问题。
-对样品进行适当的纯化和浓缩处理，以提高样品的纯度和浓度。
2.抗体选择：在ELISA实验中，正确选择适合的抗体也是非常重要的。
处理方法包括：-确保抗体的特异性和亲和力，避免与其他非特定蛋白结合。
-对抗体进行亲和纯化，以提高抗体的纯度和活性。
3.反应条件：ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等，这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。
处理方法包括：-对反应条件进行优化，确定最佳的温度、时间、pH等参数。
-控制反应时间，避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。
4.检测方法：ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。
不同的检测方法对实验结果的影响也不同。
处理方法包括：-选择合适的检测方法，根据实验的目的和需要进行选择。
-对检测方法进行优化和标准化，以提高检测的准确性和灵敏性。
5.交叉反应：ELISA实验中，样品中的其他成分可能会引起交叉反应，导致实验结果的误差。
处理方法包括：-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体，避免与其他非特定抗原结合。
-对样品进行适当的稀释，以减少交叉反应的可能性。
6.数据分析：ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。
处理方法包括：-使用适当的统计方法对实验数据进行分析，确定浓度或活性的可靠性。
-进行实验重复和平行实验，以确保实验结果的可重复性和准确性。
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酶联免疫吸附试验的影响因素
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）
是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发
等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介
导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多
个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量
ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底
物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件
样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保
存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的
离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需
要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择
ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑
其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特
异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关
重要。
4.孵育条件和时间
孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育
温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准
ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果
的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，
并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算
ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进
行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实
验结果的可靠性。
总之，以上是一些影响酶联免疫吸附试验结果的主要因素。
在进行ELISA实验时，科研人员应该仔细控制这些因素，优化实验条件，以确保
结果的准确性和可重复性。