酶组织化学和组织化学染色
酶免疫组织化学技术的操作程序
酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。
2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。
常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。
固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。
二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。
脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。
2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。
3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。
4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。
5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。
三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。
抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。
2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。
3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。
抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。
4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。
反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。
四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。
2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。
4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。
常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。
五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。
2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。
3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。
组织化学技术酶组化
五 、DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，
下面反应不直接发生：AH2（供氢体） +H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验 可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶— —底物（受氢体）复合体生成，在复合体 最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供 氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的 供氢体应是含有色原性基团的发色物质， 如奈酚和联苯胺。
2019/3/3
2．后偶联法Post-coupling（ACP） 3．合成法 4．底物膜法 设计半透膜 切片/ 孵育法 ★★★ 影响酶组化实验的关键因素 ① 酶活性的保存 a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 △ 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。 △慎用醛
a．预孵液：室温下10～30分钟 b．后孵液： Fahimi孵育液，室温5～60分钟 Gropam--Karnovsky液，室温，3~10分钟 ② 洗涤：蒸馏水漂洗 ③ 染核：亚甲蓝染核 ④ 封固：甘油明胶封固
▲ 髓性过氧化物酶显示法。
① 固定与切片：用冷的2.5％戊二醛固定30～ 60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。
⑨ 对照：必须设立对照，以防非特异反应。 这对结果的解释非常重要。 ★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题： ① 经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？ ② 酶是否在原位？ ③ 反应中多少酶起了作用？ ④ 酶的活性是否代表细胞生活时的活性？ ⑤ 沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改变？ 5 ⑥ 是否有扩散移位
［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/L
Ca2+ 浓度为10mmol/L
［注意事项］
植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
酶是广泛分布于生命有机体的组织细胞内具有催化活性的特殊蛋白质，参与体内几乎所有的细胞功能活动进程。
有些酶类还是不同亚细胞器的标志酶，如酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶，过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，葡萄糖-6-磷酸酶是内质网的标志酶，氨肽酶是微粒体的标志酶，琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶是线粒体的标志酶[1–2]。
目前，由国际生物化学酶学委员会(Enzyme Commission, EC)认定并注册登记编号的酶约有2000多种。
按照酶对底物的特异性、催化性和来源，酶的命名可分为6大类：氧化还原酶(Oxidoreductase, EC 1)、转移酶(Transferase, EC 2)、水解酶(Hydrolase, EC 3)、裂解酶(Lyase ，EC 4)、异构酶(Isomerase, EC 5)和合成酶(Synthetase, EC 6), 这些酶中已知能被现有的组织化学和细胞化学技术原位检测显示的酶仅有200多种[3]。
1980年，简收稿日期： 2014–01–09 接受日期： 2014–04–17基金项目： 广东省科技计划项目资助作者简介： 林植芳(1936~ )，女，研究员，主要从事植物生理学研究。
* 通讯作者Correspondingauthor.E-mail:***************.cn热带亚热带植物学报 2014， 22(5)： 525 ~ 536Journal of Tropical and Subtropical Botany植物酶的组织和细胞化学定位研究方法林植芳*, 刘楠(中国科学院华南植物园，广州 510650)摘要： 酶是参与植物体内生化反应的特殊蛋白质。
在保持活组织和细胞结构完整性的条件下，利用组织化学、细胞化学、免疫学和显微检测等技术研究酶的即位定位，是了解酶在组织、细胞和亚细胞中的分布、活性动态与定量及酶功能等的重要途径。
对植物体中酶定位的组织化学和细胞化学方法的概念、原理与研究进展进行了综述，并根据国际酶化学分类编号顺序，分别介绍了25种酶的组织化学染色定位所用的反应介质和染色方法及46种酶的细胞化学定位方法的参考文献。
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学检验技术—酶免疫组织化学检验技术(免疫学检验课件)
（二）技术类型 1.直接法
形成抗原一抗体一酶复合物 2.间接法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E复合物 3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法
形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E复合物
（三）方法评价
三、非标记抗体酶免疫组化染色法
（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特
异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结 合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2） 作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与 结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc 段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对 抗原的检测。
4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立
的碱性磷酸酶（AP）- 抗碱性磷酸酶（AAP） 法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。
（三）方法评价
该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于 酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗 体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的 缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥 PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原 的抗体（Ab1）与PAP复合物的抗酶抗体连 接起来Ag-Ab1-Ab2-PAP
3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体
和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比 PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏 感性。
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原的共价键作用将酶直接连接在抗体 （或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体） 与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应 后，通过酶对底物的催化作用，生成不溶 性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗 原定性、定位、定量检测的目的。
骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查
骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查是一种用于诊断血液疾病的特殊检查方法。
该检查可以通过染色技术直接观察血液细胞中特定的染色体、酶或其他化学物质，进而判断疾病的类型和程度。
下面我们将从步骤、原理及应用等多个方面进行细致的阐述。
一、步骤1.取样骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查需要从患者的骨髓中取得样本。
通常采用穿刺取骨髓的方法，使用空心针将骨髓组织抽取出来。
2.制片将采集到的骨髓组织用特定的方法制成薄片，然后将制片玻片放入预处理液中，去除组织中的脂肪和血液。
3.固定用甲醛等化学物质将薄片固定在制片玻片上，以免组织失去结构。
4.染色根据不同的需求，使用不同的染色方法染色。
常用的染色方法有Gear （G）染色、Wright（W）染色、Giemsa（G）染色、PAS染色、酶组织化学染色等。
5.观察染色完成后，使用显微镜观察染色后的组织和细胞，看到目标物质的颜色或形态变化，从而判断患者的疾病类型及程度。
二、原理骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查的原理是通过染色技术观察不同的物质反应，从而帮助医生确定患者的诊断。
例如，由于白血病细胞存在着特殊的染色体核型，因此通过染色技术可以直接观察到这些染色体。
又如，用PAS染色技术可以看到细胞中的糖原，发现是否存在糖尿病等疾病。
这些染色方法可以同时应用于细胞形态与细胞化学特性的研究。
三、应用骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查广泛用于对各种血液疾病的诊断，特别是在白血病、贫血、血小板疾病、骨髓增生异常综合症等疾病的确诊和辅助诊断中得到了广泛应用。
通过该检查方法的组织学检查，可以检查人体中蛋白质、酶液、糖原、脂肪等物质，并进一步辅助疾病的诊断和治疗。
而且，该检查方法具有操作简便、灵敏度高、结果准确等优势，可以为医生提供诊断血液疾病的重要实验依据，为患者提供更好的诊治服务。
总之，骨髓特殊染色及酶组织化学染色检查是一种具有较高研究价值和应用前景的检查方法。
酶的组织化学
靛蓝
（蓝色沉淀）
酶组化的应用
• 了解组织、细胞的代谢活动，并显示病变 所在部位以帮助诊断 • 帮助确定细胞类型 • 细胞定位和作为某些细胞分化标志 • 用于肿瘤的研究及帮助诊断 • 用于免疫组化和原位杂交的显示手段
酶
α- 萘酚磷酸钠+水 ――→磷酸氢二钠+ α萘酚
α-萘酚+坚牢蓝――→偶氮染料沉淀
联苯胺色素法
酶 无色联苯胺 脱 氢 有色联苯胺 联苯胺褐
• 用于检测过氧化物酶 eg：DAB法
四唑盐法
• 底物被氧化酶或脱氢酶作用，使底物氧化并释放 出氢，产生的氢离子被传递给受氢体（无色的四 唑盐），受氢体被还原为有色不溶性沉淀物（双 甲 formazane ） • 用于单胺氧化酶和脱氢酶 • 常用的四唑盐
• 第一反应（酶促反应）
– 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产 物，即初级反应产物(Primary reaction product, PRP)
• 第二反应（捕捉反应）
– 初级反应产物与辅助物（捕捉剂）经一步或二 步反应，生成有色不溶性的终反应产物(Final reaction product, FRP)
• 作用特点
– 高度催化效率 – 高度专一性（底物特异性）
酶的定位
• • • • 细胞核内：DNA核苷酸转移酶 细胞质内：乳酸脱氢酶 细胞膜内：碱性磷酸酶 细胞器内
– 线粒体：琥珀酸脱氢酶 – 内质网：葡萄糖-6-磷酸酶 – 溶酶体：酸性磷酸酶
酶组织化学基本原理
酶 底物 PRP(无色） 捕捉剂 FRP（有色）
转移酶 Transferases
酶的分类
水解酶 Hydrolases 裂合酶 Lyases
异构酶 Isomerases 合成酶 Ligases
酶组织化学技术
第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。
人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。
组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。
组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。
这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。
它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。
但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。
同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。
但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。
目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。
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第14章酶组织化学和组织化学染色酶酶是由细胞合成的生物催化剂，它们增加整个过程的反应速率，而自身的数量和特性不会改变。
组织化学组织化学被Pearse定义为“用化学或物理的测试方法对细胞和组织中的特定物质、反应基团和酶催化物质进行鉴定、定位和定量的方法”。
因此，采用化学方法技术将组织细胞中的物质进行定位，以用于显微观察的过程就是组织化学技术。
酶组织化学技术酶组织化学技术是将免疫学和分子生物学相结合的一种组织学技术。
组织中酶的表现与其他无活性组织成分完全不同，酶必须是具有活性的。
而且，细胞内酶的表达主要取决于酶在活性位点的特定底物和形成不溶物质，这种不溶物质随后变成有色体或不透明体。
组织必须尽可能新鲜才适合酶的表达，尸检组织/尸体解剖通常不适合用于研究。
经处理不能被用于酶表达的组织要保存在冰箱中。
对于大多数酶来说，它们的表达需要新鲜组织（如细胞培养物）或冷冻/晶体组织和冷冻干燥的组织切片，但是，一些酶如碱性磷酸酶或酸性磷酸酶对底物具有抵抗性，因此它们无法表达。
定影液冰箱冷却丙酮，并用甲醛盐水或95％乙醇作为缓冲剂，在大多数情况下，冷丙酮用于酶的表达。
酶组织化学原理组织化学方法是基于生化反应，含有酶的组织或细胞当置于溶液中时，它们与溶液发生化学反应，产生着色的不溶性产物，然后可以在细胞或组织中评估最终产品的位置和数量。
经典组织化学反应通常遵循以下四个原则之一：*简单离子相互作用。
*醛与希夫试剂或银化合物的反应。
*芳香族重氮盐与芳香族残基的偶联。
*底物和酶的转化形成着色沉淀。
酶的分类*氧化还原酶：它是一个大组，由以下亚组组成：-氧化酶：在氧气存在下催化底物的氧化。
-脱氢酶：通过除去氢原子来催化底物的氧化。
-过氧化物酶：通过除去与过氧化氢结合的氢原子来催化底物氧化。
-Diaphoresis酶：通过除去氢原子来催化NADH和NADPH的氧化。
*水解酶：催化引入水中元素成为特定的底物键。
*转移酶：催化两种化合物基团的转移，但不利用也不损失水分。
*裂解酶：催化从底物中去除基团从而形成碳双键。
脱羧酶是该组一个亚类。
组织化学反应类型主要有四种类型：1.同时捕获。
2.孵育后偶联（后耦合）。
3.自色底物反应。
4.分子内重排。
同时捕获是酶表达的最重要技术。
原理*Gomori金属沉淀技术。
*偶氮染料法。
技术路线初级反应产物（PRP）：是酶在底物上的反应的产物。
最终反应产物（FRP）：为不溶性无色PRP的产物，其已变为有色的或不透明的产物。
示例：碱性磷酸酶的重氮技术。
本反应的局限：PRP（初级反应产物）的扩散，这种扩散取决于以下因素：*PRP和重氮盐的偶联速率。
*底物的水解速率。
*缓冲区PRP的扩散系数。
*缓冲介质和重氮盐的pH值。
后耦合技术路线示例：Rutenberg和Seligman酸性磷酸酶技术。
本反应的优势：*第一次反应可持续较长时间，因为大多数重氮盐在水溶液中分解缓慢。
*酶和重氮盐的最佳pH可以单独使用。
本反应的局限：*PRP并不是完全不溶性物质。
*PRP存在某些扩散作用。
自色底物反应技术反应示例：Burstone碱性磷酸酶荧光技术。
本反应的优势不需要重氮盐配合物。
技术路线示例：Nachlas描述的羧酸酯酶技术。
对照部分酶组织化学中酶活性的表达期间应使用对照部分。
它可以通过两种方式进行准备：*将试验部分在特定底物中温育，将对照部分保存在蒸馏水中，两组进行相同的实验步骤；*另一个对照部分的获取，可以在沸水中保持15分钟（从而破坏酶）或通过在37℃下M/100氟化钠中温育60分钟来获得。
诊断应用酶组织化学技术没有广泛应用于手术和尸检的诊断。
这是因为：*当组织常规处理并加工成石蜡时，会发生酶的全部或部分失活。
*需要新鲜的组织材料。
*大多数反应的相对非特异性。
*技术的复杂性。
目前，最常用于诊断的酶组织化学方法是骨骼肌相关酶（用于肌肉相关疾病研究），乙酰胆碱酯酶（用于诊断Hirschsprung氏病）和氯乙酸酯酶（用于表达肥大细胞和骨髓细胞）的组织化学方法。
后者被称为莱德氏技术，理论基础为这些细胞中存在的酶酯酶是抵抗福尔马林固化和石蜡包埋作用的少数酸性磷酸酶之一。
这种方法应用于诊断的另一个例子是黑素细胞中的DOPA反应，可以诊断黑素细胞肿瘤。
该反应取决于酶酪氨酸酶，需要使用新鲜的组织，该技术的改进版能够在石蜡包埋材料中显现沉淀产物。
在多聚甲醛固定后，塑料包埋技术可以使各种酶的良好形态细节得以保存，即使在超微结构（电子显微镜）下也可以进行酶组织化学实验。
近来，目前酶组织化学在手术组织学中的共同应用是：*骨骼肌活检。
*在疑似Hirschsprung氏病的情况下快速方便地检测神经节和神经。
*在疑似乳糜泻的空肠活检中证明特异性乳糖酶或蔗糖酶缺乏症。
*论证白细胞的骨髓谱系和肥大细胞（氯乙酸酯酶技术）。
*其他方面（例如前列腺癌中的酸性磷酸酶和血管内皮肿瘤中的碱性磷酸酶）（表1）。
骨骼肌活检未固定骨骼肌低温恒温器存在于不同类型的肌纤维中，如I型、2A型、2B 型和2C型。
它还显示不同纤维的数量、尺寸和相对比例的变化。
常用于肌肉活检的组织化学方法：*腺苷三磷酸酶（ATPase）。
*NADPH心肌黄酶。
*磷酸。
*细胞色素氧化酶。
腺苷三磷酸酶（ATP酶）组分：低温恒温器。
试剂1．0.1M甘氨酸缓冲液：-甘氨酸：375毫克-NaCl：292.5mg用蒸馏水补足50毫升。
2．0.1M甘氨酸缓冲液，0.75M CaCl2：-0.1M甘氨酸缓冲液（溶液1）：25mL-0.75M CaCl2（氯化钙）：5mL（11.03g CaCl2·2H2O溶解在100mL蒸馏水中）充分混合，加入约11mL的0.1M NaOH使pH为9.4。
3．0.1M醋酸缓冲液，pH4.2和pH 4.6。
4．孵化溶液：-ATP：5mg-溶液2：10mL根据需要用0.1M NaOH或0.1M HCl调节至pH 9.4。
组织化学方法（pH9.4）1．在37℃孵育溶液4中孵育未固定的新鲜切割的低温恒温器部分。
2．用蒸馏水冲洗干净。
3．将载玻片浸入2％氯化钴中5分钟。
4．用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗三次。
5．浸入1：10稀释的硫化铵溶液（在通风柜中）30秒钟。
6．用自来水冲洗。
7．在哈里斯苏木精中轻轻复染。
8．用自来水染蓝。
9．分级酒精脱水。
10．在二甲苯中清除并装入DPX（或者可以在步骤8之后直接在甘油胶中进行，绕过脱水和清洗）。
组织化学方法（pH4.2和4.6）1.0.1M维罗内酯缓冲液（溶液3）中，4℃温度下孵育新鲜切片10分钟。
2.在蒸馏水中进行较短时间冲洗。
3.然后从上述方法的步骤1开始，即在pH9.4中进行。
缩写：ATPase，腺苷三磷酸酶； SDH，琥珀酸脱氢酶； LDH，乳酸脱氢酶； NADH，还原形式的NAD（烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸）。
结果*强染色图案（黑色或黑色）：++或+++*浅染色图案（粉红色）：+*阴性（无染色）。
关键点肌纤维通常根据其收缩性质分为类型1（慢收缩）和类型2（快收缩），1型纤维具有低水平的ATP酶和高水平的线粒体氧化酶，因此具有抗疲劳性。
2型纤维具有低水平的线粒体氧化酶和高的磷酸化酶活性，可以利用厌氧糖酵解（表2）。
细胞色素氧化酶组分：新鲜低温恒温器部分。
试剂（培养液）*过氧化氢酶，20μg/mL：1mL*细胞色素C：10mg*0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4：9mL*3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）：5mg*在使用前应根据需要，用0.1M NaOH或0.1M HCl将pH调节至7.4。
组织化学方法1．在室温下孵育低温恒温器2-3小时。
2．用蒸馏水冲洗。
3．固定钙中15分钟。
4．在苏木精中简单复染15-20秒。
5．在自来水中洗净并染蓝。
6．分级酒精脱水。
7．在二甲苯中清除并装入DPX。
结果棕色反应产物→意味着组织具有细胞色素氧化酶活性。
磷酸化酶组分：新鲜未固定的低温恒温器部分。
试剂（含解决方案）*0.1M乙酸缓冲液，pH5.9：50mL*0.1M氯化镁：5mL*葡萄糖-1-磷酸酯：0.5g*糖原（兔/牡蛎肝）：10mg*ATP盐：25mg*氟化钠：0.9g*乙醇：10mL*聚乙烯吡咯烷：4.5g按上述顺序混合试剂，制成培养液，培养液应保存在哥伦比亚瓶子里，并且每次孵育后应冷冻保存，当效力减弱时放弃该溶液。
组织化学方法1．37℃孵育溶液中孵育90分钟。
2．4％乙醇中洗涤5秒钟，并在空气中干燥。
3．乙醇中固定3-4分钟，在空气中干燥。
4．Lugol碘中洗涤（1：30稀释）5分钟。
结果磷酸化酶活性：蓝/黑5。
先天性巨结肠的神经和神经节检测在这种疾病中，儿童直肠和结肠的变异部分没有神经节细胞，称为神经节。
但是在正常的直肠和结肠中，神经节细胞存在于粘膜下层以及肠壁的内部圆形和外侧纵向肌肉之间的肌间神经丛中。
这些神经节和神经负责人体肠部运动和蠕动。
Hirschsprung氏病的诊断可以从临床学和放射学上考虑，但是可以采用组织化学方法，用乙酰胆碱酯酶（Hirschsprung氏病缺乏）的方式，通过吸入直肠粘膜和粘膜下层活检确认神经纤维和神经节细胞。
乙酰胆碱酯酶组织制备将快速冷冻的组织切片在低温恒温器中切割，厚度为10μm，将其风干并以钙固化30秒（含4％甲醛的0.1M乙酸钙中）。
试剂（孵化液）*乙酰胆碱碘：5毫克*0.1M乙酸缓冲液，pH6.0：6.5mL。
*0.1M柠檬酸钠：0.5mL。
*30mM硫酸铜：1mL*蒸馏水：1mL*4mM异八甲基焦磷酰胺（iso-OMPA）：0.2mL。
使用前加入1.0mL5mM铁氰化钾溶液。
组织化学方法1．用自来水冲洗10秒钟。
2．在37℃孵育液中孵育1小时。
3．短暂自来水洗涤。
4．用0.05％对苯二胺二盐酸盐在0.05M磷酸盐缓冲液（pH6.8）中室温下处理45分钟。
5．用自来水冲洗。
6．室温下用1％OsO（四氧化锇固定剂）处理切片10分钟。
47.自来水中冲洗5-10分钟。
8.Carazzi苏木精或Mayer的明矾苏木精中轻轻擦拭10秒钟。
9.分级酒精中洗涤和脱水。
10．在二甲苯中清除并嵌入DPX。
结果神经纤维和神经节细胞：含有黑色/深棕色的乙酰胆碱酯酶。
结论酶组织化学作为生物化学与形态学联系的桥梁，是基于组织酶在其原位定位（正常位置发生）的底物代谢，可视化检验不溶性染料产品。
但随着免疫组织化学和DNA导向分子病理学技术的出现，酶组织化学的潜力难以估计。
最常见的组织化学染色方法列于表3并在下面讨论；其结果显示在图1至图3中。
图1：显微照片示出带状毛霉菌菌丝广泛的无隔壁（Grocott银乌洛托品染色，×400）噬银染色噬银物质存在于细胞质中并与银离子结合，对银离子具有亲和力（亲银性），但不能将银离子还原成其可见的金属形式。
有几种方法用于显示噬银物质，这些方法与Warthin-Starry化学技术相似（用于显示螺旋体）。