第十章 微生物基因工程
微生物基因工程及其应用研究
微生物基因工程及其应用研究随着现代科学技术的不断发展，微生物基因工程得到了越来越广泛的应用。
微生物基因工程是将外源基因导入微生物细胞内，并利用微生物的自身代谢机制和酶系统来合成目标产物的一种方法。
本文将从微生物基因工程的概念、研究方法、应用及未来发展等方面来探讨这一领域的研究现状。
微生物基因工程的概念微生物基因工程是指运用生物技术手段将生物体内的基因进行改造和操作，以创造出的新生物过程。
它是通过将人工合成的基因导入到微生物的染色体中，利用细菌、酵母或其他微生物产生目标分子的一种生物学技术方法。
微生物基因工程的主要目的是开发出新型的生物工艺过程和生物产品，例如合成新型药物、生产特定蛋白质和酶、改进传统工艺过程等。
微生物基因工程的研究方法微生物基因工程是一项高度技术化的领域，其研究方法主要包括以下几个方面。
第一，选择合适的载体。
将外源基因导入到微生物细胞内需要一个合适的载体，它可以提供某些重要的基因表达元件，如启动子、终止子、选择性标记、制剂等。
第二，构建表达载体质粒。
常规的质粒载体是双链环形DNA分子，人工合成的基因可以在载体上插入预定的位置。
第三，再向菌体内引入构造好的表达质粒。
将表达质粒电转入主体细胞或用化学法转化细胞均能实现目的。
第四，筛选阳性菌落。
利用阳性筛选方法筛选菌落，确认目标基因已经成功移植到了靶细胞内并且已经被稳定的复制和表达。
第五，培养和生产。
将转化的阳性菌落从小量的培养中扩大到工业生产规模并生产工业产品。
微生物基因工程的应用微生物基因工程在农业、医疗、产业、环保等众多领域中都有着丰富的应用。
在农业领域，利用微生物基因工程技术可以获得具有高效抗病性和更高营养价值的作物；可以制造合成农药、生物制剂等，从而保护农业生产中的作物；通过微生物工程技术可以生产锌肥、输氧剂、微生物肥料、生物发酵剂等，来提高农业生产的效率。
在医疗领域中，微生物基因工程主要用于疾病的医疗和药物的生产方面。
现今很多药物都可以通过微生物基因工程技术生产，例如抗生素、生长激素、血液净化剂等。
微生物 10-4、5、6第十章 微生物的遗传变异和育种
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、 人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成 素、重组链激酶等都已先后供应市场，不仅保 证了这些药物的来源，而且使成本大大降低。 但工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳 定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发 生DNA片断脱落；表达产物不稳定。 工程菌的稳定与否，与重组质粒本身的分子组 成、宿主细胞生理和遗传性以及环境条件等因 素有关。
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否 则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染； c ）死亡。
一、菌种的衰退与复壮
衰退：菌种出现或表现出负变性状
菌种衰退的原因： ①大量群体中的自发突变
自发突变
纯菌种
不纯菌种
传代增殖
衰退菌种
原始个体
突变个体 菌种衰退的原因： ②分离现象。 菌种衰退的原因： ③培养条件与传代。
准性杂交育种
第五节 分子育种（基因工程育种）
一、基因工程 定义：在基因水平上，改造遗传物质，从而使 物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的 生物新品系。
特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性
二、基因工程的基本操作 获得目的基因
选择基因载体
体外重组 外源基因导入 筛选和鉴定
应用
通过基因工程改变后的菌株被称为“工程菌”， 工程菌已逐渐应用于药物的微生物发酵生产中， 主要有以下几个方面：①增加生物合成基因量而 增加抗生素产量；②导入强启动子或抗性基因而 增加抗生素产量；③把两种不同的生物合成基因 在体外重组后再导入受体而产生杂交抗生素；④ 激活沉默基因，以其产生新的生物活性物质或提 高抗生素产量；⑤把异源基因克隆到宿主中表达， 以期彻底改变生产工艺。
第10章 基因工程的操作过程
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵
早期胚胎培养 移植到子宫 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：CaCl2法（ Ca2+增加细菌细胞的通透性）
二、将目的基因导入受体细胞
受体细胞 内，并且在 目的基因进入 _________ （一）转化： 表达 的过程 受体细胞内维持稳定 _____和_____ 将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（二）方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——氯化钙法（感受 微生物细胞 态细胞）
载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一
个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。 第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来； 第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素 平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以 生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一 种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
2、过程:
质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
启动子
目的基因
表 达 载 体
b、启动子 c、终止子 d、标记基因
表达载体
复制原点 标记基因
终止子
e、复制原点
第10章 微生物与基因工程
➢ 多克隆位点区位于lacZ‘基因中，在此位点上插入外源基因会 导致lacZ‘基因失活，可利用蓝白斑筛选重组子 。
.
.
.
质粒的不足
（1）外源DNA≤15kb。 （2）转化效率低，约0.1％的转化率。
.
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体的优点： （1）遗传背景清楚； （2）容纳外源DNA≤23kb。 （3）高感染率100%，体外包装上外壳蛋白。 缺点：DNA分子很大；限制酶有很多切点，且多位
.
.
⑵ 插入一小段多克隆位点区
➢ 在α肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点 的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会 破坏α互补作用。这时若将M13（含外源DNA）和 宿主细胞涂布在含有IPTG和X–gal培养基的平板 上，则形成无色噬菌斑。
.
➢ M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适 于克隆300～400bp的外源DNA片段；
.
M13噬菌体的改造
➢ 野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生 型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。
➢ 在M13基因组中，除基因间隔区（IG）外，其他均 为复制和组装所必需的基因。
➢ 外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对 野生型M13的改造主要在IG区中进行。
.
⑴ 插入β－半乳糖苷酶选择标记
第十章
微生物与基因工程
基因工程技术
➢ 基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿 主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基 因产物，或令生物表现出新的形状。
.
基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，
微生物基因工程及其在工业生产中的应用
微生物基因工程及其在工业生产中的应用微生物基因工程是将外源基因注入到微生物细胞中，制造出某些特定的产品或增强某些性能。
随着科学技术的不断进步，微生物基因工程在许多领域中得到了广泛的应用。
本文将探讨微生物基因工程的概念及其在工业生产中的应用。
一、微生物基因工程的概念微生物基因工程是指通过对细菌、酵母、真菌等微生物细胞进行基因工程改造，使其获得新的生产能力和产生特定产品的能力。
微生物基因工程已经成为第三次工业革命的代表，具有巨大的发展前景。
微生物基因工程的核心技术是DNA重组技术。
这项技术可以将两条DNA分子上的特定序列进行切断和粘接，从而得到新的DNA分子。
利用这项技术，可以将外源基因注入到微生物细胞中，从而使其具备新的功能。
二、微生物基因工程在工业生产中的应用微生物基因工程在许多领域中都有着广泛的应用。
下面将从食品、医药、环保和能源领域等方面进行介绍。
1、食品领域微生物基因工程在食品领域中主要应用于生产食品添加剂、酶和微生物素等。
例如，通过改造酵母细胞，可以使其产生糖化酶来制造糖，从而使糖的生产成本大大降低。
此外，利用微生物基因工程还可以生产出一些新型的食品添加剂，例如黄酮素。
2、医药领域微生物基因工程在医药领域中有广泛的应用，主要是用于生产生物药品和诊断试剂。
例如，改造细菌细胞可以使其产生某些重要的蛋白质，例如干扰素、人胰岛素和重组人血红蛋白等。
此外，利用微生物基因工程还可以制造出一些高效的诊断试剂，例如PCR试剂盒。
3、环保领域微生物基因工程在环保领域中主要应用于污水处理、土壤修复和生物燃料生产等。
例如，改造细菌可使其具有降解有毒物质的能力，从而用于污水处理和土壤修复。
此外，利用微生物基因工程还可以制造出一些生物燃料，例如生物柴油和生物乙醇等，有望替代传统的化石燃料。
4、能源领域微生物基因工程在能源领域中的应用主要是用于生产生物燃料和生物氢等。
例如，改造细菌可使其具有产生氢气的能力，从而用于生产生物氢。
《微生物基因工程》课件
02
微生物基因工程的基本技 术
基因克隆技术基ຫໍສະໝຸດ 克隆技术定义基因克隆技术是一种将特定基因或基因片段分离出来，并在体外进行复制、剪切、拼接等 操作，最终将重组的基因或基因片段导入受体细胞，实现基因的体外操作和扩增的技术。
基因克隆技术原理
基因克隆技术的核心原理是DNA的半保留复制。通过将外源DNA片段插入到载体DNA中 ，形成重组DNA，然后将重组DNA导入到宿主细胞中，实现外源DNA的扩增。
利用基因工程改造微生物，提高生物 燃料的产量和效率，降低生产成本。
药物生产
通过基因工程手段改良微生物，实现 高效的药物生产，降低生产成本。
环境保护
利用基因工程改造微生物，提高污染 物的降解效率和速度，降低环境污染 。
农业领域
通过基因工程手段改良农作物，提高 农作物的抗逆性和产量，改善农业生 产效益。
改良农作物优点
通过基因工程技术，可以提高农作物的抗逆性、产量和品 质，为农业生产的发展做出贡献。
改良农作物挑战
改良农作物需要经过严格的试验和审批，确保安全性、有效性和 可持续性。同时需要加强农业技术的推广和应用，提高农民的素
质和能力。
04
微生物基因工程的前景与 挑战
微生物基因工程的发展前景
生物燃料
基因操作技术
包括基因克隆、转化、表达等关键技 术，是实现基因工程应用的基础。
微生物基因工程的历史与发展
起源
20世纪70年代，随着DNA双螺旋结构的发现和分子生物学的兴起 ，基因工程技术开始起步。
发展历程
经历了从简单到复杂、从单一到多基因的转化，技术不断进步，应 用领域不断扩大。
未来展望
随着基因编辑技术的发展，微生物基因工程将更加精准、高效，有 望在生物医药、生物能源等领域发挥更大作用。
微生物基因工程育种
微生物基因工程育种微生物基因工育种是通过对微生物的基因进行改造和调控，以达到改良微生物性状、提高微生物产量或开发新的功能微生物的目的。
下面是微生物基因工程育种的一般步骤：1. 目标设定：- 确定所需改良的微生物性状，如产量、抗性、代谢途径等。
- 设定预期目标并制定相应的策略。
2. 基因库构建：- 通过采集、分离和培养不同来源的微生物，获取丰富的基因资源。
- 将这些基因片段或整个基因组构建成基因库，用于后续的基因工程操作。
3. 基因选择和克隆：- 从基因库中筛选出与目标性状相关的基因。
- 进行基因克隆，将目标基因插入适当的载体中，例如质粒或病毒。
4. 基因转化：- 将经过克隆的目标基因导入到目标微生物中。
- 可以通过多种方法进行基因转化，如电转化、化学转化、高速颗粒轰击法等。
5. 基因调控和表达优化：- 对导入目标微生物的基因进行调控，使其在适当的条件下高效表达。
- 可通过引入启动子、终止子、增强子等元件来调控基因的表达水平。
6. 选择与筛选：- 利用筛选标记或筛选方法，对转化后的微生物进行筛选和鉴定。
- 筛选出具有目标性状的微生物株系，并进行进一步的评估和优化。
7. 验证和应用：- 对获得的改良微生物进行性状鉴定和功能验证。
- 如需应用于工业生产、农业等领域，可以进行中试和大规模生产验证，确保其在实际应用中的稳定性和可行性。
需要注意的是，在进行微生物基因工程育种时，需要遵循相关生物安全规范和伦理法规，确保操作的安全性和合规性。
此外，对于涉及到大规模应用的改良微生物，还需要考虑环境风险评估和监管等问题，以确保其对环境和人类的影响最小化。
食用菌生产技术 第十章 微生物的基因工程育种
基因工程
DNA提取 离体切割 载体DNA分子 重组体
连接
导入
受体细胞 得到新的物种 重组体形状表达
基因工程的步骤：
• 基因分离 • • • • 体外重组 载体传递 复制、表达 筛选、繁殖
1、基因分离 提取目的基因——密度梯度超速离心等方 法分别提取所需要的DNA（目的基因）和 作为载体的松弛型细菌质粒。 处理目的基因——加入专一性很强的限制 性核酸内切酶进行处理，从而获得带有 特定基因并暴露出黏性末端的DNA单链部 分。
Байду номын сангаас
2、体外重组
目的基因 细菌质粒 力） 5～6℃ DNA连接酶 环状重组体 （复制能
混合“退火”
3、载体传递
通过载体把供体的遗传基因导入到受体细胞内。 载体需具有自我复制的能力。
4、复制和表达 通过自我复制得到扩增，并使受体细胞表 达出供体细胞所固有的遗传特性，成为 “工程菌” 5、筛选和繁殖 目前分离纯净的基因功能单位还很困难， 所以要设法筛选出所需要性状的个体，然 后才加以繁殖和利用。
年年有余 祝君好运
第十章 基因工程育种
本章主要内容 一、基因工程概述 基 二、载体 三、基因工程酶系 四、主要步骤
基因工程育种概述
基因工程—— 又称遗传工程，即利用DNA重组技术的
方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA （目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最 后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细 胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或 最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原 有的遗传性状。
微生物基因工程技术
微生物基因工程技术微生物基因工程技术是一种利用基因工程手段来改良微生物的遗传信息，以增强其特定功能或产生有用的产物的方法。
这一技术在许多领域都有广泛的应用，包括医药、农业、环境保护等。
本文将探讨微生物基因工程技术的原理、应用以及其潜在的风险。
一、原理微生物基因工程技术是基于对微生物遗传物质的分析和操作进行的。
首先，研究人员要对目标微生物的基因组进行测序和分析，确定目标基因或基因组片段。
然后，通过基因工程手段，将外源基因或已经存在的基因进行改造和整合，使其能够在宿主微生物中稳定表达。
最后，利用特定的培养条件和发酵工艺，使得微生物能够产生所期望的产物。
二、应用微生物基因工程技术在医药领域有着广泛的应用。
通过利用基因工程手段，科学家们可以改良微生物的遗传信息，使其产生重要的药物分子，如胰岛素和人类生长激素等。
这种方法比传统的制药方法更加高效和经济，为人们提供了更多治疗疾病的选择。
此外，微生物基因工程技术还可以在农业领域得到应用。
通过改变微生物的遗传信息，可以使其具有抗虫、抗病的能力，以增加农作物的产量和抵御病害的能力，从而提高农作物的质量和抗性。
这种技术的应用在农业生产中具有巨大的潜力。
微生物基因工程技术还可以应用于环境保护领域。
例如，利用工程菌可以分解有机废物，减少环境污染。
同时，微生物也可以用来生产生物燃料，如生物氢气和生物乙醇，以减少对化石能源的依赖，降低温室气体排放。
三、风险与挑战然而，微生物基因工程技术的应用也面临一系列的风险和挑战。
首先，基因工程菌或其他微生物可能会逸出实验室环境，进入自然环境中，引发生态系统的变化。
其次，基因工程菌带有外源基因，这些基因可能会导致产物的毒性或过敏反应。
此外，人们对基因工程菌的接受程度和食品安全问题也是需要考虑的因素。
为了应对这些风险和挑战，相关的监管机构和研究人员需要进行严格的安全评估和监测。
同时，加强公众的科学教育，提高人们对基因工程技术的了解，可以增加对这一技术的认同和接受度。
微生物的基因工程
微生物的基因工程微生物是指体积微小、结构简单的生物体，如细菌、真菌等。
基因工程是利用基因技术对生物体的基因进行改造和调控的一项科学技术。
微生物的基因工程是基因工程领域中的一个重要分支，它通过对微生物的基因进行修改，可以实现对微生物的功能和特性进行精确控制，从而对人类生产和生活产生重要影响。
一、微生物基因工程的基本原理微生物基因工程的基本原理是利用生物体内的基因进行操作。
基因是生物体内传递遗传信息的单位，它决定了生物的特性和功能。
通过对微生物的基因进行修改和调控，可以改变微生物的生理特性和产生新的功能。
二、微生物基因工程的应用领域微生物基因工程在许多领域中都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 药物生产：通过修改微生物的基因，使其能够产生具有疗效的药物。
例如，利用基因工程技术可以让细菌产生抗生素等药物，从而提高药物的生产效率和质量。
2. 农业领域：通过对农业微生物的基因进行工程改造，可以提高农作物的抗病性、耐盐碱性等特性，从而增加农作物的产量和质量。
3. 环境治理：利用微生物基因工程技术可以改变微生物的代谢途径，使其能够降解污染物，从而实现环境治理的目的。
4. 能源开发：微生物基因工程可以用于生物能源的开发和利用。
例如，通过对微生物的基因进行修改，可以使其具有产生生物燃料的能力。
5. 生物工程：微生物基因工程在生物工程领域有着重要的应用。
通过对微生物的基因进行改造，可以实现对微生物的功能和特性进行精确控制，从而实现生物工程的目的。
三、微生物基因工程的发展前景微生物基因工程在生物科技领域中具有重要的地位和广阔的发展前景。
随着基因工程技术的不断发展和进步，微生物基因工程将会在更多领域发挥作用。
1. 高效生产：微生物基因工程可以提高微生物的产量和产能，使生产过程更加高效和经济。
2. 新材料研发：微生物基因工程可以实现对微生物的功能进行改造，从而开发出新的材料和产品。
3. 环境保护：微生物基因工程可以用于环境治理和污染物降解，有助于改善环境质量。
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的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含
有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体
Plac
O
高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5 Plac UV5 O
启动子
启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 阻遏蛋白 色氨酸 基底水平转录
Ptrp 除去色氨酸
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
质粒拷贝数
质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60 在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600 在此温度下，受体细胞染色体上的CI基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达
Apr MCS
PL
pCP3
ori
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅 提高 高效转录 P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 诱导 O 基底水平转录 阻遏蛋白
P
O
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区
Apr pKO1 galK 终止密码子
粒上报告基因galk的表达产物联合作用，
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子
启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
Hale Waihona Puke -10 区序列G A T A C T
细胞内tRNA的含量
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程
大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高
效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略
可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而
CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻
AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
脂多糖等非蛋白分子
包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点： 能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体 经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂 解物中分离出来 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，
即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因
本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
细胞对外源基因高效表达的制约作用
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生
长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增
殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道
溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和
或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），
便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达 Ptrp Otrp
高效转录
Ptrp
Otrp
启动子
启动子的可控性
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突 Ptrp A 阻遏作用
基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
8 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
Apr
pCP1
ori
筛选Apr、Tcs的转化子
组DNA中克隆筛选
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的
频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大
肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对
Tcr
于一些终止作用较弱的终止子，通常
可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体
上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P
位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
8 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
8 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
8 大肠杆菌基因工程
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子
终止子
核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探测
E
A
目的基因
E
目的基因 E E 启动子