课程总结：生物大分子分离纯化的总体策略
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
如何正确设计技术路线、实施方案
如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案一、通用的技术路线设计方案：1、确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。
本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。
2、建立相应可靠的分析测定方法分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。
没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。
3、查阅文献调研和预备性实验要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。
4、生物材料的破碎和处理需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。
5、分离纯化方案的选择和探索同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。
而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。
所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。
6、生物大分子纯度的检测根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。
7、产物的浓缩、干燥与保存二、常用的检测方法：1、物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
但应注意，必须同时采用 2～3 种不同的纯度鉴定法才能确定。
2、生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；三、要了解的主要理化性质：1、在水和各种有机溶剂中的溶解性。
生物大分子色谱分离及纯化
3、 AFC--亲合色谱（Affinity Chromatography）
AFC是利用配体与目标蛋白间的特异性 的亲和作用，使变性蛋白分子保留在柱的 顶端从而与变性剂分离的方式，使变性蛋 白在洗脱过程中进行复性。
生物大分子色谱分离及纯化
4、 HIC--疏水作用色谱 （Hydrophobic Interaction
生物大分子色谱分离及纯化
色谱分类(按照进样量)
1、分析色谱（10mg） 2、中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 3、制备色谱（0.1-1g） 4、工业生产规模色谱（大于20g/d）
生物大分子色谱分离及纯化
第一节 基本理论
一、计量置换保留理论
(1)溶质计量置换吸附理论。
它的核心是，当一个溶质被吸附剂吸附时， 在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一 定数目的溶剂分子。
第七章 生物大分子的色谱分离 和纯化
生物大分子色谱分离及纯化
分离方法
➢从现在分离科学理论计算得出，色谱和电泳是 目前所知最好的两种分离方法，其理论塔板数可 达百万数量级。
➢但是，因受各种因素的限制，电泳目前尚不能 用于生产规模的生物大分子的分离纯化，这就是 人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、 核酸和多糖等，以下简称蛋白）的研究重点放在 色谱上的原因。
和回收率 3、复性同时达到纯化目的 4、便于回收变性剂，生物以大分降子色低谱分废离及水纯化处理成本
1、 SEC---空间排阻色谱或尺寸排 阻 色 谱 （ Size Exclusion Chromatography）
生物大分子色谱分离及纯化
该法的复性机理为：
在变性蛋白进入柱顶端时，因有高浓度变性 剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水和半径，不能进入柱的空隙， 蛋白质在SEC柱上不保留。当受到复性的缓冲溶 液洗脱时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质浓度 降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高 能状态，这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳 定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从而使变 性蛋白质开始复性。
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子分离纯化技术(159页)
F1 平衡作用
分离主要的
依
据
极性、 位阻因素 离子性质 分子大小 极性因素
分子大小 极性因素
离子性质 离子性质
离子性质 分子大小 离子性质 离子性质
分子大小 离子性质
分子大小 分子大小 分子大小
分子大小 形状
分子大小 分子大小 介质密度
（细胞外液）
（细胞内液） 发酵液→预处理→细胞分离→细胞破碎→碎片分离→提取 → 精制 → 成品制作
静电引力，极化度分子筛效应
扩散，偶极作用， 缔合和解离效应 渗透作用, 渗透，缔合和解离效应
分子摩擦力，极化度动电作用 分子摩擦力，极化度动电作用， 表面能 分子筛效应
分子摩擦效应
分子筛效应
电动力 分子筛效应 分子筛效应，表面能（吸附） 分子摩擦效应
扩散
分子摩擦效应
占优势的 作用力
F2 F2 F2 F2 F2 F1 F1 F1和F2 平衡作用 F1 F1和F2
分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。生 物体的组成成分千千万万种，分离纯化的实验方案 也千变万化。没有一种分离纯化方法可适用于所有 物质的分离纯化，一种物质也不可能只有一种分离 纯化方法。所以对于某一种物质，究竟选用什么分 离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学 性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验 可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是 分离一个新的未知组分，根据分析和预试验的初步 结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以 帮助少走弯路。
五．结晶
六．沉降 （a）动力学的 （b）等密度的
生化分离方法分类表
推 动 力 F1
流体动力
流体动力
流体动力
流体动力 机械作用
生物大分子的分离纯化及其应用2012-文档资料
6.1 反相高效液相色谱 （RP-HPLC）
分离机理 蛋白质的反相色谱中：
①用非极性的反相介质为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、 乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。
对分离物的要求：在介质中必须带电。7.1凝胶Βιβλιοθήκη 泳主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳
7.1.1原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳 动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质， 颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳 动速度越大。
此外，还与介质PH值（蛋白质为两性电解质，有一 等电点，在不同pH值下所带净电荷的符号及数量 均不同，在电场中的泳动速率也就不同了）、电场 强度（电场强度越高，粒子泳动速度越快）、离子 强度（介质离子强度越大，粒子的泳动越慢。一般 在0.02 ～ 0.2之间）、电渗等实验条件有关。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间理化性质的差异。
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。
采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时，一般是有 针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分 离骨桥蛋白时，纯度可以达到85 %以上。
对于乳品中一些等电点较高的蛋白质，如乳铁 蛋白，采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效。
生物大分子药物分离纯化效率
生物大分子药物分离纯化效率生物大分子药物作为现代医药领域的重要组成部分，在治疗多种复杂疾病中发挥着关键作用，如单克隆抗体、胰岛素、疫苗及酶类等。
这些药物的生产过程中，分离纯化步骤尤为关键，直接关系到药品的安全性、有效性及生产成本。
以下从六个方面探讨生物大分子药物分离纯化的效率提升策略。
一、早期工艺设计的优化生物大分子药物的分离纯化效率首先在工艺设计阶段就需精心布局。
通过计算机辅助设计(CAD)和模拟技术，预先评估不同分离策略对产物收率和纯度的影响，选择最合适的初始原料、细胞培养条件和收获方法。
例如，通过优化细胞裂解条件减少杂质蛋白的释放，或是利用特定的细胞破碎技术如高压均质、酶解法，减少对目标产物的损伤，为后续纯化步骤奠定良好基础。
二、亲和色谱的高效应用亲和色谱是生物大分子药物分离中最常用的高效方法之一，它依赖于目标分子与固定相上的特异性配体之间的高度选择性相互作用。
针对不同类型的生物大分子，开发具有高亲和力和特异性的配基，如利用抗体、受体或配体对目标分子进行特异性捕获，可显著提高纯化效率和速度，同时减少杂质残留。
此外，连续流亲和色谱技术的应用进一步缩短了处理时间，提高了生产效率。
三、多模式和混合模式色谱技术的发展随着对分离机制的深入理解，多模式和混合模式色谱技术应运而生，它们结合了不同类型的相互作用机理（如疏水、离子交换、尺寸排阻等），在单一柱上实现多级分离，大大简化了分离流程，降低了成本。
这种技术通过灵活调整操作参数，如pH值、盐浓度等，可在保持高纯度的同时，提高目标产物的回收率和处理量，为复杂生物大分子的分离提供了更为高效的选择。
四、膜分离技术的进步膜分离技术，尤其是纳米过滤和超滤技术，在生物大分子药物的浓缩和杂质去除中扮演着重要角色。
通过选择合适孔径的膜材料，可以有效截留目标分子而让小分子杂质透过，或反之。
膜技术的优势在于其连续操作、易于放大及操作简便，能显著提高处理速度和降低能耗。
近年来，智能膜、复合膜及动态膜表面修饰技术的进展，进一步提高了膜的分离效率和稳定性，降低了堵塞风险。
生物大分子的纯化和结构分析
生物大分子的纯化和结构分析在生物学研究中，大分子是一个非常重要的研究对象。
它们是生物体内一些重要的分子，如蛋白质、核酸、糖类等。
这些大分子的复杂性和多样性使得它们的纯化和结构分析非常具有挑战性。
本文将探讨生物大分子的纯化和结构分析的基本原理和方法。
一、生物大分子的纯化生物大分子的纯化是生物学研究中的一个基础性实验步骤，也是研究生物大分子结构和功能的前提。
生物大分子的纯化就是把它们从其他生物体内分子中分离出来，使其达到一定的纯度，以满足后续的结构和功能研究需要。
其中，蛋白质纯化是生物学研究中的一个重要问题之一，因为蛋白质是生物体内最为重要的大分子之一。
1.1 分离方法生物大分子的纯化需要一系列的实验分离步骤。
根据大分子的化学性质和生物来源不同，分离方法也有所不同。
主要的方法包括：（1）分子排斥色谱（size exclusion chromatography）：根据分子的大小分离。
（2）离子交换色谱（ion exchange chromatography）：根据分子的电荷差异分离。
（3）亲和色谱（affinity chromatography）：根据分子的特异配体分离。
（4）逆向相色谱（reverse-phase chromatography）：根据分子的疏水性分离。
1.2 纯度检测生物大分子的纯度检测是生物学研究中的一个关键环节。
生物大分子的结构和功能的研究都需要高纯度的样品。
目前常用的纯度检测方法有：（1）SDS-PAGE：钠二十硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（2）Western blotting：蛋白质的免疫印迹。
（3）UV吸收光谱：在280纳米处进行吸光度检测。
二、生物大分子的结构分析生物大分子的结构分析是生物学研究中一个非常重要的研究领域，因为分子的结构直接关系到其功能。
目前，生物大分子的结构分析主要有两种方法：晶体学和核磁共振。
2.1 晶体学晶体学是生物大分子结构分析的传统方法。
该方法要求分子能够形成晶体，然后通过X射线衍射得到分子的三维结构。
生物大分子的色谱分离和纯化
分析色谱与制备色谱:
01
分析色谱 灵敏度 进样量
02
毛细管柱色谱
除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。
不产生热
01
不产生外力
02
高回收率
03
高分辨率
04
线性放大，可预期
05
可自动化
06
大量成功例子
07
为何选择色谱作为生物分子纯化方法？
Principles of Operation for Chromatography Techniques
浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因
而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度
梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达
到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界
层，它对水的透过起着阻碍作用.
复 习
浓差极化
01
膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流
02
速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这
最短柱长(Lmin)：混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短距离。
二﹑有效柱长和最短柱长
有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。
分离度
装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱
化学、物理吸附
操作简便
易受离子干扰
生物大分子的分离纯化方法
生物大分子的分离纯化方法由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA 沉淀，而tRNA保留在上清。
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[资料]预测未来最好的方法就是把它创造出来。
——罗曼·罗兰[法国]生物化学实验基础段训练总结生命大分子物质的性质及制备研究的基本战略概述生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
其中许多化合物至今还是个谜，有待人们研究与开发。
有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。
分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。
例如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的生物材料，才能提取出几毫克的样品。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，必须权衡利弊，综合考虑。
因而实验结果常有很大的经验成份，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
正是由于生物大分子的分离和制备是如此的复杂，因而实验方法和流程的设计就必须尽可能多查文献，多参照前人所作的工作，吸取其经验和精华，探索中的失败和反复是不可避免的，但是其乐趣与智慧也正体现于此。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。
③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
④生物材料的破碎和预处理。
⑤分离纯化方案的设计和探索，这是最关键也是最体现研究者智慧的环节。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
⑦产物的浓缩，干燥和保存。
当纯化的对象选定之后，首先碰到的问题是，此物质在哪些材料中含有？哪些材料中含量较丰富？其次是在从选定的材料提纯此物质的过程中，纯度是否逐渐增加？也就是说，所用的纯化方案是否合适？要回答这些问题就必须确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。
由于有效成分在原材料中含量较低。
这一事实决定了抽提液和纯化的前一阶段溶液中有效成分的比活性较小，加之此时测定的样品很多（每一步骤都需测定），因而确立的测定方法应简单、灵敏、花时间少。
此外，确立的方法要专一性强、可比性强。
否则，所测得的结果误差大。
鉴于实验材料的丰富多彩，对于同一种物质往往有不同的测定方法，故而在选择时总的原则是根据实验材料的生理生化特点选择干扰因素最小的方法，并在同系列操作中运用同一方法，以取得可比性。
分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。
生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。
生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够充分的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法共同映证确定。
蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更为理想。
核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH 7.0时260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。
③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。
⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。
各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等，目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。
由于生物大分子不能加热熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此两相之间交替进行分离纯化。
在实际工作中往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
纯化生物大分子总是希望纯度和产率都要高。
例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率都要高才好，但实际上两者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能的高，而牺牲一些回收率，在工业生产上则正相反。
一、生物大分子制备的前处理1 生物材料的选择制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。
材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。
从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法繁琐，流程很长，反倒不如含量低些但易于获得纯品的材料，由此可见，必须根据具体情况，抓住主要矛盾决定取舍。
从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。
除此之外，选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。
选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。
动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。
选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。
材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。
微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
生物材料如暂不提取，应冰冻保存。
动物材料则需深度冷冻保存。
2 细胞的破碎除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
(1)机械法：1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。
工业生产中可用电动研磨。
细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。
2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒～20秒，停10秒～20秒，可反复多次。
(2)物理法：1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。
破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。
使用时注意降温，防止过热。
3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。
在1000×105P a～2000×105P a的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。
在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
(3)化学与生物化学方法：1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。
使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。
2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。
4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
3 生物大分子的抽提“抽提”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH值和提取时间等。
一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。