最新双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株应用
抗生素筛选流程及步骤
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植物内生真菌抗菌活性物质的研究进展
内生真菌 Neoplaconema napellum IFB-E016 是从中 国海南植物 Hopea hainanensis 的健康叶子中获得的, 其 能产生一种新的具有抗真菌活性的化合物 neoplaether (7), 对 Candida albicans 的 MIC 为 6.2 μg/mL[8]. 2006 年,
Hu 等[9]从白菜的内生真菌 Trichoderma sp.发酵物中获 得了一个能够抑制柿子炭疽病的 13 元大环内酰胺生物 碱 IFB-Lactam-1 (8).
Tan 等[6]又从 Quercus variabilis 的一株内生真菌 Fusarium sp. IFB-121 的发酵物中分离到两个脑苷酯化 合物 3, 4, 这两个生物碱结构上的差别在于分子结构中 的 X-Y 段 . 活 性 试 验 显 示 , 这 两 个 脑 苷 脂 对 细 菌 Bacillus subtilis, Escherichia coli 和 Pseudomonas fluorescens 的 MIC 分别为 3.9, 3.9 和 1.9 μg/mL 及 7.8, 3.9 和 7.8 μg/mL. 而作为阳性对照的抗生素 BBK8 的 MIC 为 0.45, 3.9 和 3.9 μg/mL. 朱峰等[7]把混合发酵技术应用 于两株南海红树内生真菌(菌株编号 1924 和 3893)的培 养 , 结 果 产 生 了 一 个 新 的 1- 异 喹 啉 酮 类 生 物 碱 marinamide (5)和其甲酯(6). 在初步抗菌活性实验中发 现这两个化合物在浓度为 1 mg/mL 时, 对 Escherichia coli 的抑菌圈直径为 14 和 20 mm, 对 Pseudomonas pyocyanea 的抑菌圈为 9 和 17 mm, 对 Staphylococcus auereu 的抑菌圈为 10 和 13 mm, 很明显其甲酯的抗菌 活性要比 marinamide 好.
琼脂扩散法敏感试验（改良Kirby-Bauer法）
琼脂扩散法敏感试验(改良Kirby-Bauer法) 若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小，来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
一、试验用材料（一）培养基Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。
琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
(二)药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。
采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。
药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。
用以下两个指标判定纸片的质量：1．片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。
测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。
纸片琼脂扩散实验报告
一、实验目的1. 了解纸片琼脂扩散法的原理和操作步骤。
2. 掌握纸片琼脂扩散法的应用，评估细菌对不同抗菌药物的敏感性。
3. 分析实验结果，为临床用药提供依据。
二、实验原理纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）是一种常用的细菌药敏试验方法。
其原理是将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，药物在琼脂中扩散，形成递减的浓度梯度。
当纸片周围的药物浓度低于细菌的最小抑菌浓度（MIC）时，细菌生长被抑制，形成无菌生长的透明圈，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物浓度和细菌敏感性呈负相关。
三、实验材料1. 细菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。
2. 抗菌药物纸片：青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素等。
3. 琼脂培养基：水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton琼脂，MH琼脂）。
4. 无菌器械：接种环、镊子、酒精棉球等。
5. 环形量器、纸片分配器、计时器等。
四、实验步骤1. 准备工作：将MH琼脂培养基熔化，待冷却至约45℃时，倒入平板中，待凝固。
2. 接种：用接种环挑取适量细菌菌种，涂布于平板表面，均匀分布。
3. 贴药片：用纸片分配器或镊子将抗菌药物纸片贴于平板表面，纸片中心距离平板边缘不小于15mm，纸片间距不小于24mm。
4. 观察与记录：将平板放入37℃恒温箱中培养18-24小时，观察并记录抑菌圈的大小。
5. 结果分析：根据抑菌圈的大小，查阅药物敏感谱，判断细菌对不同抗菌药物的敏感性。
五、实验结果与分析1. 金黄色葡萄球菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为敏感，抑菌圈直径分别为15mm、10mm、20mm；对庆大霉素表现为耐药，无抑菌圈形成。
2. 大肠杆菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为18mm。
3. 肺炎克雷伯菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为16mm。
根据实验结果，金黄色葡萄球菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟敏感，对庆大霉素耐药；大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感；肺炎克雷伯菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感。
47种中草药提取物的体外抗菌活性筛选研究
47种中草药提取物的体外抗菌活性筛选研究左国营;韩峻;余巍;徐贵丽;王根春【期刊名称】《中国药房》【年(卷),期】2005(016)010【摘要】目的:测定47种中草药的80%乙醇提取物的体外抗菌活性.方法:对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌进行抗生素药敏试验;制备47种中草药醇提物,采用常规琼脂扩散法进行体外抑菌试验.结果:47种中草药的醇提物中有11种对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌有不同程度的抑制活性;其中尤以赤芍和石榴皮的醇提物抗耐药菌活性最高,赤芍醇提物对上述3种菌特别是耐药菌的抑制活性均较高,其最低抑菌浓度(MIC)分别为13、11、18mg/ml;石榴皮醇提物对上述3种菌的抑制活性也较高,其MIC分别为83、36、23mg/ml.结论:赤芍和石榴皮醇提物呈现广谱抗菌特性,且具有抗耐药菌作用.【总页数】2页(P798-799)【作者】左国营;韩峻;余巍;徐贵丽;王根春【作者单位】成都军区昆明总医院药剂科,昆明市,650032;云南中医学院,昆明市,650031;成都军区昆明总医院药剂科,昆明市,650032;成都军区昆明总医院药剂科,昆明市,650032;成都军区昆明总医院药剂科,昆明市,650032【正文语种】中文【中图分类】R285【相关文献】1.36种中药材体外抗菌活性筛选研究 [J], 胡欢;左国营;张泽萍2.22种中草药提取物体外抗菌实验研究 [J], 孙茜;左国营;郝晓燕;王根春;韩峻;符思梅3.基于微量筛选模型的48种中草药提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选及评价 [J], 周思多;王晓;冯金红;耿岩玲;赵恒强4.23种中草药的体外抗菌活性筛选研究 [J], 张泽萍;胡欢;左国营5.20种中草药提取物的体外抗菌作用研究 [J], 傅瑞春;左国营;王根春;韩峻;张学辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海鞘真菌的形态鉴定及其代谢产物抗菌活性研究
海鞘真菌的形态鉴定及其代谢产物抗菌活性研究罗国聪;黄蕴怡;柴慧子;雷晓凌;聂芳红【摘要】为寻找产生新颖抗菌活性物质的海洋真菌,以海鞘为原料,采用平板涂布法分离出14株真菌,并对其进行形态学鉴定和抗菌活性的初筛.结果显示:从海鞘中共分离出14株真菌,根据形态观察初步鉴定其分属青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、枝孢属(Cladosporium sp.)、麦轴梗霉属(Tritirachium sp.)等4个属.14株菌中有抗菌活性的共11株,优选出抗菌活性较强抗菌谱较广的4株菌分别是Asc-2-4(青霉属)、Asc-2-12(青霉属)、Asc-1-1(青霉属)和Asc-2-1(曲霉属).青霉属菌株Asc-2-12的抑菌活性最明显,抑菌圈直径最大达到21.91 mm.海鞘共附生真菌是寻找抗菌物质的一个资源,其中的3株青霉属和1株曲霉属的抗菌活性有深入研究的价值.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)009【总页数】5页(P244-248)【关键词】海鞘;共附生真菌;形态鉴定;抗菌活性【作者】罗国聪;黄蕴怡;柴慧子;雷晓凌;聂芳红【作者单位】广东海洋大学食品科技学院,湛江524088;广东海洋大学食品科技学院,湛江524088;暨南大学生命科学技术学院,广州510632;广东海洋大学食品科技学院,湛江524088;广东海洋大学食品科技学院,湛江524088【正文语种】中文由于海洋高盐、高压、低温、寡营养等特殊生境，使得海洋微生物可产生结构新颖的生物活性物质，包括抗肿瘤、抗炎症、抗菌、抗寄生虫等化合物，海洋微生物已经成为新型药物开发的重要来源。
尤其是海洋动植物共附生微生物，积极地参与动植物的代谢活动，在动植物的抗感染、抗吞噬的生态防卫中起了重要的作用［1］。
而就近几年已报导的数据来看，从海洋微生物中发现的新活性物质中，有60% 以上来自于海洋真菌［2-3］。
1株海洋乳酸菌的鉴定及生物学特性的初步研究
1株海洋乳酸菌的鉴定及生物学特性的初步研究赵鸭美;刘林;安静莹;钟敏;胡雪琼;刘颖【摘要】对从南海海域沙虫(Sipunculus nudus)肠道分离到的1株海洋乳酸菌ZH-101,通过形态学及生理生化特性实验,并结合16S rRNA序列同源性分析,将其鉴定为棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp,torquens).采用双层牛津杯琼脂扩散法测定其发酵上清液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、黑曲霉6种指示菌的抗菌活性并对该菌做了部分生长特性研究.结果表明,其发酵液对食品中常见的腐败菌、致病菌有良好的抑制作用,该菌株最适生长温度为30℃,最适pH为6.0,培养6h后进入对数期,18h后生长进入稳定期.【期刊名称】《北京联合大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(027)002【总页数】5页(P59-63)【关键词】乳杆菌;分离鉴定;抑菌活性;生物学特性【作者】赵鸭美;刘林;安静莹;钟敏;胡雪琼;刘颖【作者单位】广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东普通高等学校水产品深加工重点实验室,广东湛江524088【正文语种】中文【中图分类】Q93-3310 引言乳酸菌作为一种益生菌广泛应用于食品行业中，它能抑制或杀死一些食品腐败菌和致病菌，改善食品风味，调节人体肠道菌群的生态平衡，有利于身体健康［1］。
近几年不断报道，一些乳酸菌在代谢过程中产生一种或多种具有抑菌活性的多肽或前体多肽即细菌素，具有抗菌性强、抑菌谱广、安全无毒等特点，是开发天然食品防腐剂的重点研究方向［2］。
我国南海海域广阔，海洋生物资源丰富、种类繁多，特殊的海洋生存环境使海洋生物具有与陆生生物不同的生理性状，并产生许多结构新颖、作用特殊的生物活性物质，是寻找乳酸菌新种和具有特殊功能的生理活性物质的重大来源［3-5］。
本研究对从南海海滩沙泥中挖出的沙虫(Sipunculus nudus)肠道中分离得到的一株细菌进行多相鉴定，对其发酵液进行了抑菌活性实验，并对它的生物学特性进行了初步研究。
琼脂扩散法
琼脂扩散法
琼脂扩散法是一种检测细菌的便捷易行的方法，是一种检测不同菌株特异性抗性的快速方法。
其原理是细菌越长发生越大，最终形成斑块状或类似于牙膏一样的条状，这种斑块或条状由细菌所形成的细菌抗原，高分子量细胞外多糖（EPS）和脂肪多糖等所组成。
琼脂扩散法中，先用琼脂对细菌悬液进行涂抹，再在琼脂培养基表面左右扩展，细菌随之扩散，形成抗原斑块或条状。
通过计算斑块的显色位置及直径及颜色的饱和度了解不同菌株的抗性情况。
琼脂扩散法要求使用高品质的琼脂，琼脂种类有甲酰粉酶消化琼脂，半乳酸琼脂，色谱琼脂，γ-琼脂乙醇悬液，甲酰粉酶消化琼脂是最常用的琼脂，常用其悬液培养细菌。
实验步骤：
（1）将琼脂液加入琼脂碗内，涂抹均匀后，表面抹平，在琼脂碗内结块。
（2）将悬液细菌加入琼脂碗中，涂抹均匀，放入培养箱密封培养，在规定的温度，湿度和时间下进行培养，直至抗原体内细菌扩散。
（3）用细胞管移液器取发酵后琼脂碗内材料，并置入斯氏培养箱中，在37℃、pH7.2的发酵液中，看到细菌抗原反应结果。
（4）制作斑块谱图，计算斑块直径大小及显色颜色饱和度。
琼脂扩散法除了检测菌株抗性外，还可用于筛选靶菌药物。
它通过测试菌株的扩散特征及分离、鉴定药敏感的菌株，从而较为直接和客观地评价药物的效果，因而有助于药物研发。
琼脂扩散试验的实验报告
琼脂扩散试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过琼脂扩散试验来研究不同浓度的抗生素对细菌生长的影响，以及评估抗生素的抗菌活性。
实验原理：琼脂扩散试验是一种常用的抗菌活性测定方法。
在该试验中，细菌被接种到琼脂平板上，随后在平板上打孔并加入不同浓度的抗生素。
随着抗生素在琼脂中扩散，其周围的细菌生长受到抑制，形成透明或半透明的抑菌圈。
抑菌圈的直径可以作为抗生素抗菌活性的指标。
实验材料：1. 细菌培养物（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）2. 抗生素溶液（如青霉素、链霉素等）3. 琼脂培养基4. 培养皿5. 打孔器6. 移液枪7. 无菌操作器材实验步骤：1. 制备琼脂培养基，并在培养皿中倒入适量的培养基，待其凝固。
2. 将细菌培养物稀释至适当的浓度，然后均匀涂抹在琼脂平板上。
3. 使用打孔器在琼脂平板上打孔，孔的间距应保持一致。
4. 使用移液枪将不同浓度的抗生素溶液加入到孔中。
5. 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中培养24-48小时。
6. 观察并记录抑菌圈的直径。
实验结果：实验结果显示，随着抗生素浓度的增加，抑菌圈的直径也相应增大。
这表明高浓度的抗生素具有更强的抗菌活性。
此外，不同种类的抗生素对同一细菌的抗菌效果也存在差异。
实验讨论：本实验结果与预期相符，说明琼脂扩散试验是一种有效的抗菌活性测定方法。
然而，实验中也存在一些局限性，例如抗生素的扩散速率可能受到琼脂厚度和孔间距的影响。
因此，在进行实验设计时，需要考虑这些因素以确保结果的准确性。
结论：通过本次琼脂扩散试验，我们成功地评估了不同浓度抗生素的抗菌活性，并观察到抑菌圈直径与抗生素浓度之间的正相关关系。
本实验为抗生素的筛选和抗菌效果评估提供了一种简单而有效的方法。
参考文献：[1] 张三. 微生物学实验技术[M]. 北京：科学出版社，2010.[2] 李四. 抗生素的抗菌活性测定方法[J]. 微生物学报，2015,55(3): 345-350.注：以上内容为示例文本，实际实验报告应根据实验结果和具体实验过程进行撰写。
广西钦州湾红树林抗菌活性菌株 Erwinia sp ．5-8的筛选及发酵条件的优化
广西钦州湾红树林抗菌活性菌株 Erwinia sp ．5-8的筛选及发酵条件的优化孟令洋;姜伟;张培玉;林学政【期刊名称】《海洋科学进展》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法从国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室广西钦州湾红树林微生物资源库中筛选获得一株具有明显抑菌效果的菌株5‐8，对该菌株进行了分子鉴定与系统发育分析。
结果表明，此菌为欧文氏菌属（Erw inia）。
通过单因子试验对其发酵条件进行了优化，优化后发酵条件为：最佳氮源为蛋白胨，最佳碳源为葡萄糖，发酵培养基初始pH值为8．0，发酵温度为25℃，盐度为1．5，摇瓶装液量30％，接种量为1％（V种子液∶V培养液＝1∶100）。
%In this study ,an antimicrobial bacterium strain ,named 5‐8 ,was screened and isolated from man‐grove of Guang Xi by the method of agar diffusion using Staphylococcus aureu as the indicator strain .The results of molecular identification and phylogenetic analysis showed that this strain belonged to genera of Erwinia .The single factor experiments on the fermentation conditions were conducted and the optimized parameters were as follows :the best nitrogen source is peptone ,the best carbon source is glucose ,the starting pH of medium was 8 .0 ,fermentation temperature was 25℃ ,salinity was 1 .5% ,liquid volume in erlenmeyer flask was 30% and inoculation amount was 1% (Vseed liquid/Vnutrient solutio =1∶100) .【总页数】9页(P270-278)【作者】孟令洋;姜伟;张培玉;林学政【作者单位】青岛大学环境科学与工程学院，山东青岛266071; 国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061;国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061; 国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室，山东青岛266061;青岛大学环境科学与工程学院，山东青岛266071;国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061; 国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室，山东青岛266061【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp.WG-007的筛选及发酵优化 [J], 刘旭梅;李恒;蒋敏;龚劲松;许正宏;史劲松2.产抗菌活性红树林放线菌G15发酵条件的优化 [J], 詹萍;李福连3.响应面法优化广西红树林菌种Erwinia sp.5-8产抗菌活性物质的发酵条件 [J], 邱晨;孟令洋;张培玉4.红树林沉积物来源链霉菌HA6菌株发酵条件的优化 [J], 肖静;洪专5.广西山口8种红树林内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选 [J], 肖胜蓝;雷晓凌;佘志刚;林诗敏;李翰祥;王力卫;刘亚月;刘颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。