基因功能研究常用方法
验证基因功能的方法
验证基因功能的方法As science and technology continue to advance, the study of genetics has become increasingly important in understanding various biological processes. One of the key challenges in genetics is verifying the function of specific genes. This involves determining the role a gene plays in an organism's development, behavior, or overall health. There are several methods that researchers use to validate gene function, each with its own strengths and limitations.科学技术的不断进步，使得遗传学研究在理解各种生物过程中变得愈发重要。
遗传学中的一个关键挑战是验证特定基因的功能。
这涉及确定一个基因在生物体的发育、行为或整体健康中发挥的作用。
研究人员用于验证基因功能的方法有几种，各有其优势和局限性。
One common method used to validate gene function is through knockout studies, where a specific gene is intentionally disrupted or "knocked out" in an organism. This allows researchers to observe the effects of the gene's absence on the organism's phenotype. Knockout studies are valuable in determining the essentiality of a gene for a particular biological process.验证基因功能的一种常见方法是通过基因敲除研究，其中特定基因在生物体中被故意破坏或“敲除”。
研究基因功能的流程
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研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
基因注释与功能分类
基因注释与功能分类基因注释是对生物基因组序列中的基因进行研究和分析，目的是确定基因的技术特征和确定基因的功能。
它是遗传学、基因组学和蛋白质组学等领域的热门研究课题。
基因功能分类是根据基因所编码的蛋白质功能来对基因进行分类。
基因功能分类的目的是帮助研究人员更好地理解和研究基因的功能，为生物学、医学等领域的研究提供支持。
基因注释的方法和技术非常多样，包括基因定位、基因表达分析、功能预测、突变分析等。
下面将详细介绍一些常用的基因注释和功能分类的方法。
第一，基因定位。
基因定位是将已知的基因位置与新的基因组序列进行比对，从而确定新的基因在基因组中的准确位置。
这种方法是通过计算机程序对基因序列进行比对，根据一系列的比对算法和标准确定基因的位置。
基因定位的目的是确定基因的位置，为后续的基因表达分析和功能预测提供基础。
第二，基因表达分析。
基因表达分析是研究基因在不同组织和细胞类型中的表达水平和模式。
通过比较基因在不同组织和细胞类型中的表达差异，可以了解到基因的功能和调控机制。
常用的基因表达分析方法包括：Northern blot、RT-PCR、Microarray、RNA-Seq等。
这些方法可以分析基因在不同组织和细胞中的表达变化，推测基因的功能和参与的生物过程。
第三，功能预测。
功能预测是根据已知的基因序列和结构特征推测基因可能的功能。
根据基因序列中的启动子序列、转录因子结合位点、启动子甲基化和组蛋白修饰等特征，结合生物信息学的分析方法，可以预测基因可能的功能。
常用的功能预测方法包括：序列比对、蛋白结构模拟、进化比较等。
这些方法可以根据不同的特征对基因进行功能预测，并通过实验验证进一步确定基因的功能。
第四，突变分析。
突变分析是研究基因突变与疾病相关性的一种方法。
通过对已知的疾病相关基因进行突变分析，可以确定基因突变与疾病的相关性。
突变分析常用的方法包括：点突变分析、插入突变分析、删除突变分析等。
这些方法可以帮助研究人员理解基因突变对疾病发展的影响，为疾病的治疗和预防提供指导。
功能基因组学的基本研究思路与基本方法
功能基因组学的基本研究思路与基本方法功能基因组学，听起来像是一个高大上的专业名词对吧？别急，今天就带你走进这个有点“深奥”却又超有趣的领域，让你明白这玩意到底是怎么回事。
你知道吗？其实功能基因组学不是什么高高在上的学术语言，它就是帮助我们弄清楚基因在生物体内到底是干什么的。
咱们人体里有成千上万的基因，它们每一个都像是一个小小的工人，埋头在不同的岗位上忙碌着。
那这些工人到底在干嘛？它们有没有默契合作？这一切，就是功能基因组学要解开的谜团。
哎，你想想，咱们日常生活中，有些人特别擅长做饭，有些人擅长修电脑，大家在自己的“岗位”上发挥特长。
基因也是一样，它们各有分工。
功能基因组学就是要告诉我们，这些“基因小工人”在细胞里面扮演什么角色，如何配合，甚至是他们的工作出错会有什么后果。
想像一下，如果厨房里负责切菜的人突然拿错了刀，结果把土豆切成了蒜瓣，哈哈，后果可想而知！功能基因组学的研究，不就是要找出那些“出错”的基因吗？就是这么一回事。
说到研究方法嘛，那可真是五花八门。
咱们简单聊几种，毕竟一提到方法，很多人都头大。
不过你放心，我不会让你感觉像是读了一本《基因学大辞典》。
最常见的一种方法叫基因表达分析。
这个听起来有点复杂对吧？简单说，它就是看看哪些基因在某个时间点特别活跃。
就好比一个办公室，大家有时忙得团团转，有时又像是开了个假期。
所以，基因表达分析就相当于在记录每个基因“上班”的情况，看看他们究竟啥时候最忙，忙些什么，或者是根本没动静。
另外一种常用方法叫基因敲除，顾名思义，就是把某个基因“敲掉”，看看它不在时会发生什么。
就像在一个车间里，工人突然消失，大家还会正常运作吗？这个方法能帮我们了解某些基因是不是特别重要，或者是说，没有了它，大家还能正常工作。
就像是你家猫咪，突然变得特别粘人，原来是家里有了新鲜的空气净化器，它的基因变化影响了它的行为。
听起来是不是很有意思？不过也不是所有敲除都那么简单，毕竟有些基因真的是“全能工人”，一不小心就会把整个系统搞崩溃。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
《基因功能分析》课件
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
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Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶
碱性磷酸酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
（三）目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
• cDNA
• 基因组DNA
（四）基因载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• 逆转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌
技术水平：分子克隆
细胞克隆
即DNA 克隆
个体克隆（动物或植物）
DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化
或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。
配伍末端连接
非配伍末端连接
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式 转化
转染
感染
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
（二）克隆载体的选择和构建 若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制. 在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
（三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接
1. 质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（臵换型，适用基因组克隆）
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
外源基因与载体的连接
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
弄清基因的生物学功能,才能明确基因 在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生 的分子机制。常用的基因功能研究技术包 括： （1）DNA克隆技术 （2）转基因技术和核转移技术（动物克隆） （3）基因敲除技术 （4）反义技术 （5）RNA干涉技术
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子
宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因
转基因动物(transgenic animal)
——目源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。
也称基因克隆或重组DNA 。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）