自噬及其研究方式
自噬荧光研究方法及具体步骤
自噬荧光研究方法及具体步骤自噬（Autophagy）一词来源于古希腊语，是“auto”（自我）与“phagein”（吞噬）的结合。
自噬发生在细胞内，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜囊泡（自噬体），进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
在自噬过程中，自噬体的形成是关键，其直径平均500nm，囊泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。
与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。
细胞质中的线粒体等细胞器首先被囊泡所包被，这种囊泡主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
自噬观察检测方法：1．透射电镜下直接观察自噬体Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
2．利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 （LC3-II）。
故而LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
3．在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
单荧光检测系统该系统通过外源表达系统在宿主细胞中过表达GFP-LC3B 融合蛋白。
细胞自噬的分子机制与调控研究
细胞自噬的分子机制与调控研究
细胞自噬是一种通过降解细胞内受损或多余的蛋白质和细胞器，以维持细胞内稳态的过程。
它的分子机制和调控涉及多个步骤和复杂的信号网络。
一、分子机制
1. 自噬泡的形成：自噬泡是由双层膜结构形成的，包括内层膜和外层膜。
内层膜通常是由溶酶体或内质网等细胞器的一部分形成的，而外层膜则是由细胞膜的一部分形成的。
2. 自噬泡与目标物的结合：自噬泡会识别并包裹细胞内受损或多余的蛋白质和细胞器。
这个过程需要一系列的蛋白复合物和信号分子的参与。
3. 自噬泡的成熟和降解：自噬泡在形成后，会逐渐成熟并降解其内容物。
这个过程需要一系列的酶和蛋白参与，包括溶酶体酶、自噬相关蛋白等。
二、调控
1. mTOR和AMPK途径：mTOR和AMPK是细胞自噬过程中的重要调控因子。
mTOR可以通过抑制自噬的起始阶段来调节自噬，而AMPK则可以通过激活自噬相关蛋白来促进自噬。
2. ULK1和Beclin-1：ULK1和Beclin-1是自噬过程中的关键蛋白，它们在自噬的起始阶段发挥重要作用。
ULK1可以促进自噬相关蛋白的聚集，而Beclin-1则可以促进自噬泡的形成。
3. 营养和压力状态：细胞营养和压力状态也是影响自噬的重要因素。
在营养缺乏或应激条件下，细胞会启动自噬以适应环境变化。
总之，细胞自噬的分子机制和调控是一个复杂而精细的过程，需要多个步骤和信号网络的参与。
对这一过程的研究有助于我们更好地理解细胞的稳态维持机制，并为疾病治疗提供新的思路。
细胞自噬的机制和功能研究
细胞自噬的机制和功能研究细胞自噬是一种通过溶酶体降解额外或有害的细胞成分的重要细胞内保护机制。
这个过程可以通过一些细胞器或胞质的生物发生来实现。
细胞自噬的机制和功能在细胞学、生物学和医学中具有重要意义。
在过去几十年中，研究者通过在各种器官和组织中观察细胞自噬的现象，实现了对这个过程的深入了解。
以下是对细胞自噬机制和功能的研究的总结。
细胞自噬的机制细胞自噬是由多种信号途径和分子机制调控的。
其中，根据形成位置和机制不同，细胞自噬被分为宏自噬和微自噬两种。
在宏自噬中，细胞通过形成双层膜来捕获或包裹细胞成分，将其转运到溶酶体，然后把其分解成单独的物质。
在微自噬中，呈膜结构的细胞成分被直接构成或毛细管系统被伪标记，然后融合到溶酶体中。
宏自噬的过程可以分为几个步骤：分别是加载、分泌、合并、淋巴酯酶（LIPA）降解、高分子碎片溢出。
细胞首先通过酪氨酸蛋白激酶mTOR抑制信号途径，启动细胞自噬过程。
ATG1-ATG13复合物（ATG：细胞自噬相关蛋白）会被蛋白酶范围B1（PRRB1）所磷酸化，并被解离成单独蛋白。
然后ATG9将蛋白质袋射向源液泡，ATG16L继续补充包翅膀袋的蛋白酶，形成汽车路线。
ATG16L 会与ATG7蛋白修饰酶结合，产生膜的存在。
接着，ATG9/ATG8与LC3/AA定量招聘，从而形成包囊。
包囊可通过光刻版等工具精确制备，并且可以清晰的观察。
一旦包袱出现，加载ATG9/ATG16L和LC3/AA的途径也变得更加显著。
通常，这些被指定为夹克球（topology-specific index），并且在细胞中具有非常强的存在感。
最后，细胞通过LIPA将细胞成分降解成单独的物质。
微自噬涉及的许多因子与宏自噬相同。
然而，微型成分的组织和细胞可以与宏自噬的物质不同。
这个过程通常与固定成分有关，包括蛋白，DNA人差一点没打成原来的去氧核糖核酸（DNA）。
在微自噬过程中，每个微自噬小囊泡是由内部单层囊泡贯穿对向的两个细胞膜创造的。
生物自噬过程的研究进展
生物自噬过程的研究进展随着科技的进步和发展，生物领域的研究也已经取得了许多重要的进展。
而自噬作为一种细胞的自我调节和清理机制，近年来在生物学研究中也得到了越来越广泛的关注。
本文将介绍一些生物自噬过程的研究进展。
一、自噬的基本概念自噬是细胞通过溶酶体（lysosome）或其他酶类体内受害物质的加速降解过程。
在某些情况下，细胞需要消耗内部蛋白质、脂质或其他细胞器来维持生存，所以会通过吞噬自身结构来获取能量或原料，这就是自噬。
自噬是由各种自噬体组成的复杂的生物学事件，包括细胞膜的扩张和内袋形成、囊泡完成后的融合、受噬物的降解和产生的废物物质的清除过程。
自噬的过程随时都在发生，这是一个非常重要的基本生物学过程，对生物体的生长、分化、应激反应和抵御病原体等方面都具有重要的作用。
二、自噬受体的发现与研究自噬的过程有许多不同的启动方式，其中最重要的是自噬受体。
自噬受体是一种能识别细胞中垃圾蛋白并“捕捉”它们的复合物，然后将其转运到自噬小体中进行降解。
多年来，许多关于自噬受体的研究一直在进行中。
最近的研究表明，自噬是通过ATG8家族成员和自噬受体融合在一起的。
这种自噬受体要求相应的ATG8家族成员参与组成，并依赖于膜融合来提供受噬物的限定。
三、自噬的重要生物学意义自噬的生物学意义是非常重要的。
近年来的研究表明，自噬在调控能量的平衡、细胞发育和生长、组织的分化和代谢过程中都起着至关重要的作用。
此外，自噬还用于预防癌症的发生和发展，并被用于治疗一系列疾病的药物研究。
四、自噬与疾病的关联自噬的功能异常通常会造成一定的生物学问题。
最近的研究表明，自噬与多种如炎症、神经退行性疾病、代谢性疾病等各类疾病有明显的关联。
例如，自噬和阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）之间存在一定的联系。
自噬在扩大贡献侵蚀细胞的β-淀粉样蛋白（β-amyloid）沉着物的清除中发挥了重要作用；自噬受体FAK在降解β-amyloid方面也具有重要功能，因此给予对自噬和自噬受体抑制的药物也会使β-amyloid沉积增多。
细胞自噬的基础知识与研究进展
细胞自噬的基础知识与研究进展细胞自噬（autophagy）是指细胞自身分解和回收废弃物质的一种过程，具有维持细胞内环境平衡、细胞生长、代谢和身体适应力等方面的重要作用。
它是细胞生物学领域中的一大研究热点，得到了广泛关注。
一、细胞自噬的三种类型细胞自噬分为三种类型：微型自噬（microautophagy）、宏型自噬（macroautophagy）和小体自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。
其中，微型自噬与宏型自噬是非选择性自噬，而小体自噬则是选择性自噬。
微型自噬是指细胞通过直接将废物分解成小的空泡来完成清除废物的过程。
宏型自噬则是通过将废物包裹进一个由双层膜组成的泡膜内，使其与溶酶体融合、分解的过程。
而小体自噬则是通过由Hsc70蛋白、LAMP-2A和HSP90组成的复合物来识别、捕获并分解特定蛋白质的过程。
二、细胞自噬的生化机制细胞自噬不仅涉及大量的细胞生物学蛋白质，还涉及到一些细胞内化学物质。
自噬的基本过程首先涉及由Atg（autophagy-related gene）基因编码的多种蛋白质在细胞内的调节作用。
这些蛋白质可以调节自噬与外环境的联系，以及与涉及的细胞运输相关的分解系统的作用。
细胞自噬的开始通常是由Atg1和Atg13等蛋白复合体的存在调节的，这些蛋白质作为自噬衍生的起点，启动成为自我糖化的起点。
蛋白复合体说大多是保存在细胞滋生蛋白（ER）突出物内或腺苷酸酰化酶（mTOR）等控制细胞自我代谢的重要酶中。
细胞自噬的早期主要涉及细胞内与mTOR有关的信号转导通路和PtdIns3K（磷脂酰肌醇3-激酶）通路。
其中，mTOR通路通过进一步活化Ras相关蛋白、主导蛋白（PKB或AKT）等蛋白的更多生物活性，使得下游的Atg1和Atg13蛋白被阻止，从而抑制细胞自噬的过程。
而PtdIns3K通路则是自噬开始的关键，它通过生成PtdIns3P（磷脂酰肌醇3-磷酸）在细胞的自噬小泡形成中发挥了作用。
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
细胞自噬现象的研究与应用
细胞自噬现象的研究与应用自噬是指细胞内的一种生理现象，当细胞出现异常或受到外界刺激时，会通过释放酶来分解组成细胞的蛋白质、脂肪等细胞器，从而获得能量和新的物质，以保持细胞的正常运行。
自噬现象在生物学研究中一直备受关注，它拥有广泛的应用价值，涉及多个领域，比如医学、生物技术等。
对于细胞自噬现象的研究，最初是在20世纪50年代由Christain de Duve发现并提出的，他主要是通过对酵母的研究，发现酵母细胞在多种条件下可以发生细胞自噬。
自此以后，人们开始对细胞自噬的机制和调控机制进一步深入研究。
随着研究的不断深入，越来越多的科学家开始探究自噬现象在生物学中的应用。
这个领域最为显著的例子是，自噬现象在治疗疾病方面的应用。
比如研究发现，自噬现象在抗病毒抵御感染过程中起着重要的作用。
当感染进入到宿主细胞中的时候，细胞便会对病毒进行自噬分解，进而消除病毒。
因此，对于一些抗病毒物质的研究，就需要关注细胞自噬现象的调控和作用机制，以期从更深层次上研究治疗疾病的新途径。
除了医学领域的应用，细胞自噬现象还涉及到一些其他的领域。
比如，在生物技术领域，自噬现象也有着广泛的应用。
比如，自噬信号通路的研究可以为基因工程、药物开发等领域提供有效的技术支持；自噬信号通路对植物的营养代谢也有着重要的影响，这对于粮食生产和提高农业生产的效率也有着重要的作用。
同时，自噬现象的研究还有助于理解和防治许多心理疾病。
例如，自闭症是一种与自噬相关的神经发育异常病例，它对人的语言、社交、情感和行为产生了影响。
进一步研究自噬在神经发育中的作用，可以帮助人们更好地理解和预防类似的疾病。
综上所述，细胞自噬现象在生物学的研究中有着很多的应用价值，涉及到医学、生物技术等领域。
通过对细胞自噬现象的了解和研究，我们可以更好地理解细胞的生理和代谢过程，从而为未来的疾病治疗、研发和生产提供更有效的技术支持。
我们相信，随着科技和研究的不断提高，细胞自噬在新领域中的应用和探索也将有着更精彩的表现。
免疫细胞自噬及其功能研究
免疫细胞自噬及其功能研究随着细胞生物学研究的深入，自噬已经逐渐成为了人们关注的热点问题，而免疫细胞自噬则成为了其中备受关注的一个分支。
免疫细胞自噬是指免疫细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞等）通过自噬途径进行杀菌、抗病毒、调节免疫应答等免疫功能。
近年来，越来越多的研究表明，免疫细胞自噬在人体健康与疾病中扮演着重要的角色。
本文旨在探讨免疫细胞自噬的相关研究进展。
一、自噬介导的免疫清除反应免疫细胞通常负责通过吞噬和吸收外来病原体，来对抗病毒和细菌等微生物的侵袭。
在这个过程中，细胞会通过吞噬的方式把病原体等物质包裹起来，形成一种被称之为吞噬体的结构。
这些吞噬体中的病原体会通过溶酶体内的消化酶而被消化，从而达到清除外来病原体的目的。
随着研究的深入，人们发现免疫细胞还能通过自噬途径来进行免疫清除反应，而且这种免疫清除反应比一般的吞噬反应更为高效。
自噬介导的免疫清除反应和一般的免疫清除反应相比，除了更加高效外，还具有更加广泛的应用范围。
例如，自噬介导的免疫清除反应不仅可以清除细胞内的病原体，还可以清除外来病原体，如细菌、真菌和病毒等等。
二、自噬介导的细胞应激反应除了免疫清除反应之外，自噬过程还能介导一些与细胞应激相关的生理反应。
例如，在胶质细胞中，自噬过程对于控制神经退化疾病和炎症反应是至关重要的。
还有一些研究表明，自噬过程对于心肌缺血再灌注损伤、钙离子平衡、金属离子代谢等细胞生理过程也有着重要意义。
三、自噬蛋白在免疫细胞中的发挥自噬过程依靠的是一系列特定的自噬蛋白，其中最为重要的蛋白之一就是ATG5。
ATG5是自噬过程所必需的基因之一，它能够参与各种自噬机制的调节，从而对自噬过程的进行起到至关重要的作用。
近年来的研究表明，ATG5不仅参与自噬过程，还对免疫细胞的功能产生重要影响。
ATG5基因的缺失会导致免疫细胞的活性下降，并且容易产生免疫调节失衡等问题。
另外，一些研究表明，自噬蛋白还能通过调节MHC-II分子的合成和代谢，来参与免疫细胞的抗原呈递过程。
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自噬（Autophagy）及其研究方式概述一、背景概念:目前依照发生进程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA), 大自噬（Macroautophagy）即咱们说的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成份的一种方式;分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮忙未折叠蛋白转位入溶酶体。
通常说的自噬泛指Macroautophagy.自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调剂蛋白，可是诱发阈值和门坎不同，如何转换和和谐目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部份表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部份胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体（autophagosome），最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
自噬的步骤能够可能总结为下面四步:步骤1：细胞同意自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并非呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观看到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成份，包括细胞器，全数揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。
电镜下观看到自噬体是自噬发生的铁证之二。
有2个特点：一是双层膜，二是内含胞浆成份，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情形不是必然要发生的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞从头利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
自噬的特性：1）自噬是细胞消化掉自身的一部份，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。
事实上，细胞正常情形下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。
这些诱发因素很多，也是研究的热点。
既有来自于细胞外的（如外界中的营养成份、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。
由于这些因素的常常性存在，因此，细胞维持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2）自噬进程专门快，被诱导后8min即可观看到自噬体（autophagosome）形成，2h 后自噬溶酶体（autolysosome）大体降解消失。
这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3）自噬的可诱导特性：表此刻2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是预备时期。
第二是自噬体的快速大量形成，这是执行时期。
4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5）“捕捉”胞浆成份的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是第一考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此不管是物种间、仍是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来自噬进程的调控：从上面总结的自噬特点中能够看出，自噬这一进程一旦启动，必需在度过危机后适时停止，不然，其非特异性捕捉胞浆成份的特性将致使细胞发生不可逆的损伤。
这也提示咱们在研究自噬时必然要动态观看，任何横断面的研究结果都不足以评判自噬的活性。
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白同意信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较确信的有：抑制类1）Class I PI3K pathway （PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS (Insulin receptor substrate) 结合，同意胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。
能同意多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的转变,rapamycin是最典型最经常使用的自噬兴奋剂.激活类1）Class III PI3K结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。
3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA能够作为自噬的抑制剂.二、自噬的研究方式：汉恒生物已开发并完善了多套自噬相关的研究体系和工具,并积存了丰硕的自噬研究体会。
正常培育的细胞自噬活性很低，不适于观看，因此，必需对自噬进行人工干与和调剂，经报导的工具药有：（一）自噬诱导剂1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）3）Earle's平稳盐溶液：制造饥饿4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂5）Rapamycin：mTOR抑制剂(这是最经常使用的)6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）除选用上述工具药外，一样还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干与：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株挑选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后，需对自噬进程进行观看和检测，经常使用的策略和技术有：1）观看自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构，一般光镜下看不到，因此，直接观看自噬体需在透射电镜下。
Phagophore的特点为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成份的趋势。
自噬体（AV1）的特点为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成份，如线粒体、内质网、核糖体等。
自噬溶酶体（AV2）的特点为：单层膜，胞浆成份已降解。
（autophagic vacuole，AV）2）在荧光显微镜下采纳GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：(经常使用) GFP-LC3单荧光指示体系：由于电镜耗时长，无益于监测（Monitoring）自噬形成。
咱们利用LC3在自噬形成进程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个敞亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，能够通过计数来评判自噬活性的高低。
汉恒生物已开发出高效的评判用GFP-LC3病毒载体，通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站成功评判自噬流。
双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。
mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性灵敏，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,现在只能检测到红色荧光。
咱们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后显现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数能够清楚的看出自噬流的强弱。
如以下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处置2小时后显现明显增强的自噬和自噬流。
3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的转变以评判自噬形成（LC3抗体购自sigma，L8918）。
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变成（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估量自噬水平的高低。
（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。
方式2和3需结合利用，同时需考虑溶酶体活性的阻碍。
）4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评判自噬和自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被以为是随机的,可是后来的研究说明有些蛋白是seletively降解的,在这些蛋白当中研究的最为透彻的是蛋白p62,p62 is selectively incorporated into autophagosomes through direct binding to LC3 and is efficiently degraded by autophagy ; thus, the total cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity. (p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系)三、自噬与肿瘤的关系：与凋亡（在肿瘤细胞中一样都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。
不管是肿瘤细胞仍是正常细胞，维持一种基础、低水平的自噬活性是相当重要的。
因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这要紧靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；若是将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并显现神经元退化。
同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供必然的能量和合成底物，能够说，自噬确实是一个“备用仓库”。
如Atg-5缺点的小鼠在诞生后喝上第一口奶之前就会饿死。
更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，有利于细胞的存活。
鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大益处：1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞离开原发灶游走时等都会显现营养不足或供给中断，而现在提高自噬活性能够有助于度过这一危机。