自噬研究方法
细胞自噬的分子机制与调控研究
细胞自噬的分子机制与调控研究
细胞自噬是一种通过降解细胞内受损或多余的蛋白质和细胞器，以维持细胞内稳态的过程。
它的分子机制和调控涉及多个步骤和复杂的信号网络。
一、分子机制
1. 自噬泡的形成：自噬泡是由双层膜结构形成的，包括内层膜和外层膜。
内层膜通常是由溶酶体或内质网等细胞器的一部分形成的，而外层膜则是由细胞膜的一部分形成的。
2. 自噬泡与目标物的结合：自噬泡会识别并包裹细胞内受损或多余的蛋白质和细胞器。
这个过程需要一系列的蛋白复合物和信号分子的参与。
3. 自噬泡的成熟和降解：自噬泡在形成后，会逐渐成熟并降解其内容物。
这个过程需要一系列的酶和蛋白参与，包括溶酶体酶、自噬相关蛋白等。
二、调控
1. mTOR和AMPK途径：mTOR和AMPK是细胞自噬过程中的重要调控因子。
mTOR可以通过抑制自噬的起始阶段来调节自噬，而AMPK则可以通过激活自噬相关蛋白来促进自噬。
2. ULK1和Beclin-1：ULK1和Beclin-1是自噬过程中的关键蛋白，它们在自噬的起始阶段发挥重要作用。
ULK1可以促进自噬相关蛋白的聚集，而Beclin-1则可以促进自噬泡的形成。
3. 营养和压力状态：细胞营养和压力状态也是影响自噬的重要因素。
在营养缺乏或应激条件下，细胞会启动自噬以适应环境变化。
总之，细胞自噬的分子机制和调控是一个复杂而精细的过程，需要多个步骤和信号网络的参与。
对这一过程的研究有助于我们更好地理解细胞的稳态维持机制，并为疾病治疗提供新的思路。
生物自噬过程的研究进展
生物自噬过程的研究进展随着科技的进步和发展，生物领域的研究也已经取得了许多重要的进展。
而自噬作为一种细胞的自我调节和清理机制，近年来在生物学研究中也得到了越来越广泛的关注。
本文将介绍一些生物自噬过程的研究进展。
一、自噬的基本概念自噬是细胞通过溶酶体（lysosome）或其他酶类体内受害物质的加速降解过程。
在某些情况下，细胞需要消耗内部蛋白质、脂质或其他细胞器来维持生存，所以会通过吞噬自身结构来获取能量或原料，这就是自噬。
自噬是由各种自噬体组成的复杂的生物学事件，包括细胞膜的扩张和内袋形成、囊泡完成后的融合、受噬物的降解和产生的废物物质的清除过程。
自噬的过程随时都在发生，这是一个非常重要的基本生物学过程，对生物体的生长、分化、应激反应和抵御病原体等方面都具有重要的作用。
二、自噬受体的发现与研究自噬的过程有许多不同的启动方式，其中最重要的是自噬受体。
自噬受体是一种能识别细胞中垃圾蛋白并“捕捉”它们的复合物，然后将其转运到自噬小体中进行降解。
多年来，许多关于自噬受体的研究一直在进行中。
最近的研究表明，自噬是通过ATG8家族成员和自噬受体融合在一起的。
这种自噬受体要求相应的ATG8家族成员参与组成，并依赖于膜融合来提供受噬物的限定。
三、自噬的重要生物学意义自噬的生物学意义是非常重要的。
近年来的研究表明，自噬在调控能量的平衡、细胞发育和生长、组织的分化和代谢过程中都起着至关重要的作用。
此外，自噬还用于预防癌症的发生和发展，并被用于治疗一系列疾病的药物研究。
四、自噬与疾病的关联自噬的功能异常通常会造成一定的生物学问题。
最近的研究表明，自噬与多种如炎症、神经退行性疾病、代谢性疾病等各类疾病有明显的关联。
例如，自噬和阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）之间存在一定的联系。
自噬在扩大贡献侵蚀细胞的β-淀粉样蛋白（β-amyloid）沉着物的清除中发挥了重要作用；自噬受体FAK在降解β-amyloid方面也具有重要功能，因此给予对自噬和自噬受体抑制的药物也会使β-amyloid沉积增多。
自噬研究指南第四版
自噬研究指南第四版引言自噬作为一种维持细胞稳态的重要机制，近年来受到了广泛的研究关注。
本文将介绍自噬的定义、调控机制、功能以及在疾病中的作用，希望能为自噬研究工作者提供指导和参考。
一、自噬的定义自噬是一种细胞通过溶酶体降解细胞内垃圾和损伤的细胞器来维持细胞稳态的过程。
自噬是一种高度保守的进化机制，在真核生物中普遍存在。
二、自噬的调控机制自噬的调控机制非常复杂，包括信号通路的激活、自噬体的形成和自噬体的降解等多个步骤。
目前已经发现了一系列关键蛋白质，如mTOR、ULK1和Beclin 1等，它们参与了自噬信号的传导和自噬体的形成。
三、自噬的功能自噬在维持细胞的能量代谢平衡、清除细胞内有害物质和维持细胞器的稳态等方面起着重要作用。
自噬还参与了细胞凋亡、免疫应答和发育等生物学过程。
四、自噬在疾病中的作用近年来的研究发现，自噬与多种疾病的发生发展密切相关。
例如，自噬在肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病中扮演重要角色。
因此，深入了解自噬在疾病中的作用机制对于疾病的预防和治疗具有重要意义。
五、自噬研究方法在自噬研究中，常用的方法包括免疫印迹、荧光染色、转基因动物模型和基因敲除技术等。
这些方法可以帮助研究人员揭示自噬的分子机制以及自噬在疾病中的作用。
六、自噬的前景自噬作为一个重要的细胞生物学过程，在疾病治疗和药物开发中具有潜在的应用前景。
通过干预自噬过程，可能可以开发出新的治疗策略，为各种疾病的治疗带来新的希望。
结论自噬是一种维持细胞稳态的重要机制，其调控机制复杂多样，功能广泛且多样化。
自噬在疾病的发生发展中扮演着重要角色，因此深入研究自噬的分子机制和功能对于疾病治疗具有重要意义。
希望本文能为自噬研究工作者提供指导和参考，推动自噬研究的进一步发展。
生物学中的细胞自噬研究
生物学中的细胞自噬研究细胞自噬是指细胞通过调节内部的分解机制来消化自身的部分成分。
生物学家发现，细胞自噬是一种十分重要的细胞过程，能够掌控生物体内部的营养平衡，帮助生物体应对环境的变化。
本文将探讨细胞自噬的秘密，以及其在人类健康中的作用。
一、什么是细胞自噬细胞自噬是细胞内部一种特殊的生物化学过程，其目的是将细胞中废物或老化组织进行分解和再利用。
细胞自噬通过吞噬、分解和重新利用完整或部分细胞成分的方式，来实现身体细胞内部新陈代谢的一种途径，从而解决细胞功能紊乱、蛋白质代谢及其他糖脂代谢相关的问题。
二、细胞自噬的种类虽然细胞自噬是一个统一的过程，但是细胞自噬还包括几个不同的类型，这些类型取决于吞噬的目标物和桥梁分子的类型。
其中最常见的类型是微粒体自噬和内质网自噬。
三、细胞自噬的机制细胞自噬的具体过程可以分为四个阶段: 诱导、吞噬、成囊和降解。
诱导阶段是通过信号通路引发的，如：减少ATP浓度、增加钙离子浓度、蛋白质过剩以及肿瘤抑制因子的表达等，常常被认为是刺激细胞自噬产生的主要动力源。
吞噬阶段是细胞自噬的另一个关键步骤，此时细胞膜中一段膜质液滴器会包裹细胞内部的目标物，然后通过与细胞膜溶酶体的融合，将吞噬后的物质封装到成囊中。
成囊阶段是指吞噬的物质经过多次酶反应，转化为小颗粒，在细胞中暂时积累。
接着它们会被再次吸附和降解为小的分子，继续应用到新的蛋白质合成刺激过程中，从而实现循环利用。
降解是细胞自噬的最后一个环节，与上面提到的成囊、吞噬以及诱导阶段共同决定了细胞自噬的完整过程。
在这个过程中，通过虹吸运输机器将已经分解的废物从体内送出，最终实现细胞内新陈代谢的途径。
四、生物学中的细胞自噬研究细胞自噬是一个相对新颖的研究领域，但是自从1980年代开始，就引起了生物学家们的十分高度关注。
自噬的过程非常重要，不仅对哺乳动物和其他动物产生影响，也对真菌、植物、昆虫及其它微生物提供了重要作用。
研究表明，细胞自噬在癌症、失智症、心血管疾病等许多疾病的发生过程中扮演着重要角色。
自噬研究指南第四版
自噬研究指南第四版摘要：一、自噬研究概述1.自噬的定义及作用2.自噬研究的意义和应用领域二、自噬研究方法1.细胞自噬实验方法2.动物模型建立与应用3.生物信息学分析与高通量技术三、自噬研究中的关键技术1.荧光显微镜观察自噬现象2.蛋白降解途径的检测与分析3.自噬相关基因与信号通路的研究四、自噬研究的伦理与法规1.实验动物的福利与伦理审查2.人类样本采集与使用的法律规定3.生物安全与实验室管理五、自噬研究的未来展望1.自噬在疾病治疗中的潜在应用2.自噬研究在生物产业的发展前景3.国际合作与交流的重要性正文：自噬研究指南第四版，旨在为广大科研工作者提供关于自噬研究的基本理论、实验方法、关键技术及伦理法规等方面的全面指导。
自噬作为一种细胞内的降解途径，对于细胞代谢、生长发育以及应对外部压力具有重要意义。
近年来，自噬研究在我国得到了广泛关注，并在生物学、医学等领域取得了世界领先的成果。
一、自噬研究概述1.自噬的定义及作用自噬是细胞内一种重要的降解途径，通过双层膜结构的自噬小体将细胞内的蛋白质、细胞器等有害物质包裹起来，并将其送入溶酶体进行降解。
这一过程有助于细胞清除有害物质，维持内环境稳定，同时还可以为细胞提供营养和合成原料。
2.自噬研究的意义和应用领域自噬研究对于揭示细胞代谢调控、生长发育、免疫应答等生物学过程的分子机制具有重要意义。
此外，自噬在神经退行性疾病、肿瘤、代谢性疾病等疾病的发生发展中发挥着重要作用，因此研究自噬有望为这些疾病的治疗提供新的策略。
二、自噬研究方法1.细胞自噬实验方法细胞自噬实验方法包括：荧光显微镜观察自噬现象、免疫荧光染色检测自噬相关蛋白、western blot检测自噬通量的变化等。
2.动物模型建立与应用常用的自噬动物模型有：基因敲除鼠、基因过表达鼠、药物诱导的自噬模型等。
这些模型可用于研究自噬在生长发育、疾病发生发展中的作用。
3.生物信息学分析与高通量技术生物信息学分析主要包括：基因表达谱、蛋白质组学、代谢组学等数据的研究。
线粒体自噬研究套路
线粒体自噬研究套路线粒体自噬是指细胞通过自噬途径去降解和清除不再需要的线粒体的过程。
这是一种非常重要的细胞自我保护机制。
近年来线粒体自噬的研究取得了很多重要的进展。
下面我们来了解一下对线粒体自噬进行研究的套路。
第一步：诱导线粒体自噬要研究线粒体自噬，我们需要先诱导细胞进入线粒体自噬状态。
对于哺乳动物细胞，最常用的诱导剂是卡铵霉素(Carbonyl cyanidem-chlorophenyl hydrazone，CCCP)。
CCCP是一种线粒体膜电位抑制剂，可以导致线粒体驱逐电子传递链中的质子，从而破坏线粒体膜电位。
这会导致线粒体的自噬作用被激活。
第二步：检测线粒体自噬一旦成功诱导细胞进入线粒体自噬状态，我们需要对线粒体自噬进行检测。
最常用的方法是通过检测自噬体膜表面LC3-I到LC3-II的转化。
LC3是一个关键的自噬体膜标志蛋白。
LC3-I是未修饰的形式，而LC3-II是已修饰的膜结合形式。
通过Western blot等方法，可以检测不同浓度的CCCP作用下LC3-I到LC3-II的转化情况来确定线粒体自噬的程度。
第三步：检测线粒体活性除了检测线粒体自噬之外，我们还需要检测线粒体的活性。
这可以通过测量线粒体膜电位和ATP合成活性等判断。
线粒体膜电位和ATP 合成活性是线粒体功能的关键指标。
通过比较诱导线粒体自噬前后的这些指标，可以确定线粒体自噬对于线粒体功能的影响。
第四步：检测线粒体DNA线粒体DNA是线粒体维持其功能的关键基因组成部分。
通过测量线粒体DNA的完整性，可以了解线粒体自噬对于线粒体基因组的影响。
常用的方法是测量线粒体DNA剪切产物的水平来判断线粒体DNA的完整性。
总结：以上就是围绕线粒体自噬研究的一些套路。
通过以上步骤，我们可以全面地了解线粒体自噬对于细胞功能和基因组的影响，有助于更深入地理解和破解线粒体自噬这一细胞自我保护机制的内在机理。
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
细胞自噬过程的实验探究与调控研究
细胞自噬过程的实验探究与调控研究细胞自噬是一种细胞内的重要代谢过程，它在调控细胞内物质的降解与再利用中起着至关重要的作用。
近年来，科学家们通过一系列实验探究和调控研究，逐渐揭示了细胞自噬的机制和调控方式，为疾病治疗和药物研发提供了新的思路。
细胞自噬的实验探究是基础研究的重要方向之一。
科学家们通过使用细胞培养和动物模型等实验手段，深入研究了细胞自噬的各个环节，从而揭示了其详细的分子机制。
例如，通过观察细胞自噬相关蛋白的表达和定位，科学家们发现自噬体的形成是细胞自噬过程的关键步骤之一。
进一步的实验研究表明，自噬体的形成依赖于一系列自噬相关基因的表达和相互作用。
这些发现为深入理解细胞自噬的机制提供了重要线索。
除了实验探究，科学家们还通过调控研究，寻找调控细胞自噬的新途径和靶点。
一方面，他们通过基因敲除和过表达等技术手段，研究了一些关键基因在细胞自噬中的功能。
例如，科学家们发现ATG5基因的敲除会导致细胞自噬的显著下降，从而证明了ATG5在细胞自噬中的重要作用。
另一方面，科学家们还通过药物筛选等方法，寻找能够调控细胞自噬的化合物。
他们发现一些化合物能够显著促进或抑制细胞自噬的发生，这为开发新的药物治疗策略提供了候选物。
细胞自噬的实验探究和调控研究不仅有助于我们深入了解细胞自噬的机制，还为疾病治疗和药物研发提供了新的思路。
细胞自噬在许多疾病的发生和发展中起着重要作用，如肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病等。
通过研究细胞自噬在这些疾病中的异常表达和功能改变，科学家们可以找到新的治疗靶点和策略。
例如，一些研究表明，通过调控细胞自噬的活性，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，为肿瘤治疗提供新的思路。
此外，一些药物研发公司也已经开始开发针对细胞自噬的药物，以期望在疾病治疗中发挥作用。
综上所述，细胞自噬的实验探究和调控研究在科学研究和医学领域中具有重要意义。
通过深入研究细胞自噬的机制和调控方式，我们可以更好地理解细胞的代谢过程，为疾病治疗和药物研发提供新的思路和靶点。
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MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;
Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;
400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;
3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成
用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些
无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了
Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
sigma的氯喹的货号C6628。
用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。
1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制剂机制不同。
抑制的步骤也不同。
有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。
因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。
氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。
Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。
研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
药物有：
自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。
氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;
MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡
单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。
具体操作步骤如下:
(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;
(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM 的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;
(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;
(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。
流式细胞术检测细胞自噬发生率
(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出
六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;
(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;
(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;
(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;
(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鮮育完的上清,2000rpm,离心5 min;
(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;
(10)重复步骤(6)和(7);
(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。
流式细胞
仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。
LC3B WB: 1:2000
条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可
LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min。