各种酶固定方法
各种酶固定方法
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。
这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
酶的固定方法
酶的固定方法
1. 包埋法！就像给酶穿上一件温暖的保护衣，把它包裹起来。
比如说做豆腐，那凝固剂不就把豆浆里的蛋白给固定住啦！
2. 吸附法呀，这就好像磁铁吸住铁钉一样，让酶稳稳地待在那里。
想想活性炭吸附异味，不就是这样嘛！
3. 交联法呢，这不就是把酶像系鞋带一样给交联起来嘛。
好比用绳子把好多东西绑在一起，变得更牢固。
比如做手工的时候用线把一些小零件绑紧。
4. 共价结合法，哎呀，就像是两个好朋友紧紧拉着手不分开。
就像粘东西用强力胶一样，特别牢固，比如粘鞋子的时候。
5. 离子结合法，这不就有点类似电荷相互吸引嘛。
就如同带相反电荷的小球会吸到一起，像电池的正负极呀。
6. 微囊化法哟，就像给酶造了一个小小的家。
好比把珍贵的东西放在一个精致的小盒子里保护起来，比如放首饰的小盒子。
7. 薄膜法，这就如同给酶盖上了一层薄薄的被子。
就像手机贴膜一样，好好地保护着。
8. 亲和层析法，哇哦，这简直就是酶的专属“相亲会”呀。
就好像找对象一样，找到最合适的那个，比如配对钥匙和锁。
9. 自组装法，嘿，这不就是它们自己就很有默契地组合起来了嘛。
像拼图一样，自己就找到了合适的位置，比如玩拼图的时候。
我的观点结论就是：这些酶的固定方法都各有特点和用处，都很神奇很有趣呀，能让酶更好地为我们服务呢！。
纤维素酶—木聚糖酶—漆酶的共固定化
纤维素酶—木聚糖酶—漆酶的共固定化纤维素酶、木聚糖酶和漆酶是植物细胞壁复式结构中重要的3种酶，也是降解该复式结构和合成植物细胞壁相关糖苷键的关键因素。
它们可以帮助植物细胞壁的强度和分解，从而分解产生植物细胞壁的原料。
共固定化技术可以有效的运用于三种类型的酶，利用这种技术可以高效的将三种酶共同固定在一个可随机分离的载体上，使它们能够有效的作用在一个催化体系中，从而使整个催化体系的性能得到提高。
在利用这种技术进行共固定化之前，需要先了解三种酶的特性及其作用。
纤维素酶是一种降解纤维素和半纤维素的酶。
它能够将纤维素类物质分解成糖原和半乳糖，也就是说，它能够将纤维素分解成更小的片段，从而更容易被植物细胞吸收利用。
木聚糖酶是一种能够降解木聚糖的酶，木聚糖是植物细胞壁中最重要的成分之一，由它和纤维素组成植物细胞壁的复式结构。
因此，木聚糖酶可以帮助植物细胞壁分解，使它们能够更有效的利用木聚糖。
漆酶是一种能够降解漆素的酶，漆素是植物细胞壁的一种重要成分，它可以使植物细胞壁表面的分子间的结合较为牢固，这样植物细胞壁才能够较为牢固地被细胞吸收，而漆素也能够减少植物细胞壁的渗漏性，从而保护细胞的稳定性。
共固定化技术可以有效的利用纤维素酶、木聚糖酶和漆酶的作用，将它们共同固定在一个可随机分离的载体上，从而使它们能够有效高效的催化单一催化体系中的反应。
这种方法可以有效的利用三种酶的联合作用，从而有效的将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解，也可以通过利用植物细胞壁复式结构中的糖苷键反应来合成新的有机物，从而实现植物细胞壁复式结构的合成和分解。
此外，使用共固定化技术的另一个优势是能够更有效的利用酶的活性。
共固定化可以有效的将三种酶以较高的活性结合在一起，从而提高整个催化体系的性能，更有效的利用酶的活性，从而将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解和合成。
此外，共固定化技术还具有一定的可操作性、可组装性特征，可以根据需要将多种酶混合，可以控制混合酶的比例，进行更加精确的操作，从而更好的利用混合酶的作用，节约成本，提高混合酶的性能。
酶六章酶的固定化
迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。
酶的固定化技术
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CON3 +E-SH R-O-CH2 –CO-S-E
定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
酶的固定化技术
三、固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
酶的固定化技术
（2）界面聚合法： 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原
理包埋酶。 例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶
液混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和 有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
酶的固定化技术
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。
酶的固定化技术
四、固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究
酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究标题：酶和辅酶的固定化及辅酶再生的研究导言：酶是生物体内非常重要的催化剂，能够加速化学反应的速率。
然而，酶在自由状态下使用存在一些限制，如易受温度、pH和抑制剂的影响等。
为了克服这些限制，研究人员开始探索酶的固定化技术，其中一种关键的固定化方法是将酶和辅酶结合起来，并寻求方法再生辅酶以提高酶的可持续使用性。
本文将深入探讨酶和辅酶的固定化方法以及辅酶再生的研究成果。
主体：1. 酶的固定化方法1.1 物理吸附固定化1.2 包埋固定化1.3 共价键结合固定化2. 辅酶的选择与固定化2.1 辅酶的种类与功能2.2 辅酶的固定化方法3. 辅酶再生的研究3.1 生物辅酶再生技术3.2 化学辅酶再生技术4. 酶和辅酶固定化的应用4.1 工业生产中的应用4.2 医学和生物技术领域的应用5. 对酶和辅酶固定化研究的观点和理解1. 酶的固定化方法酶的固定化技术是将酶通过不同的方法固定在固体载体上，以增强其稳定性和可重复使用性。
1.1 物理吸附固定化是一种简单的方法，将酶通过物理吸附作用固定在载体表面。
然而，物理吸附固定化的稳定性较低，容易受到环境因素的影响。
1.2 包埋固定化是将酶包裹在多孔载体内部，形成一种保护层，提高了酶的稳定性和抗环境因素的能力。
1.3 共价键结合固定化是通过共价键将酶与载体结合，形成较为牢固的固定化结构，提高了酶的稳定性和耐受性，但可能影响酶的活性和底物转化效率。
2. 辅酶的选择与固定化辅酶是酶催化反应过程中的辅助分子，可以与底物结合并催化其转化。
常见的辅酶包括辅酶A、辅酶NAD+等。
选择合适的辅酶并进行固定化，可以进一步提高酶的催化效率和稳定性。
2.1 不同辅酶的种类具有不同的催化功能，如辅酶A在能量代谢中起到重要作用，辅酶NAD+在氧化还原反应中起到关键作用，这些特性对选择合适的辅酶进行固定化具有指导意义。
2.2 辅酶的固定化方法包括共价键结合固定化、交联固定化等，这些方法可以使辅酶与酶固定化结构相连，提高催化效率和稳定性。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
酶固定方法
酶固定方法嘿，咱今儿个就来唠唠酶固定方法这档子事儿！你说酶这玩意儿多神奇呀，就像个小魔法师，在各种化学反应里大显身手。
那要怎么把它好好地固定住呢？先来说说吸附法吧！这就好比是给酶找个舒服的小窝，让它能安安稳稳地待着。
就像你找到一个特别合心意的座位，舒舒服服地坐着不想起来。
通过一些有吸附能力的材料，把酶吸附在上面，让它乖乖地发挥作用。
这种方法简单又直接，是不是挺有意思？再讲讲包埋法呀，这就好像给酶穿上了一层保护衣。
把酶包裹在一个小小的空间里，让它既能活动，又不会乱跑。
就像给小宝贝裹上温暖的小毯子，既安全又舒适。
这样酶就能在它的小天地里好好工作啦。
还有共价结合法呢！这就像是给酶和载体之间系上了一条牢固的绳子，把它们紧紧地绑在一起。
它们就成了亲密无间的伙伴，一起面对各种挑战。
这种结合可是很牢固的哟，酶也能更稳定地发挥作用啦。
交联法也不能落下呀！这就好像把好多酶聚集在一起，形成一个强大的团队。
它们相互支持，共同努力，让反应进行得更顺利。
是不是感觉很厉害？每种方法都有它的特点和优势呢！就像不同的工具，在不同的场合都能发挥大作用。
咱在选择的时候可得好好琢磨琢磨，根据具体的情况来决定用哪种方法最合适。
比如说，如果咱想要操作简单方便，那吸附法可能就是个不错的选择；要是想要更稳定更长久的效果，共价结合法或者交联法也许更合适。
这就跟咱挑鞋子一样，得根据要去的地方、要做的事情来选合适的那双。
而且呀，在实际应用中，还可能会把这些方法结合起来用呢！就像咱做饭的时候，会把各种调料搭配起来，让味道更美味。
这样能让酶固定得更好，发挥出更大的作用。
总之呢，酶固定方法可真是个有趣又重要的领域。
它就像一把钥匙，能打开很多神奇的大门，让酶在各种领域大显身手。
咱可得好好研究研究，让这些小魔法师更好地为我们服务呀！怎么样，现在对酶固定方法是不是有了更清楚的认识啦？。
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一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。
分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。
根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。
处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。
在60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。
以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。
其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。
大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。
2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。
称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环泵中,搅拌器搅拌反应 24h。
过滤,测定上清液的蛋白质含量。
抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。
三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。
2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。
称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。
3、果糖转移酶的固定化方法用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。
交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫泡待用。
4、酶活测定方法游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。
5、惰组分测定方法采用 HPLC( 高效液相色谱)法。
HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。
6、酶活力定义每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。
酶用量为 2U/g 蔗糖。
固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的测定方法。
固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。
四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定1、海因酶的制备将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。
蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C下保存备用。
2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3• H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。
以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。
3、 EDC 溶液的配置称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。
4、环氧基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。
4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。
5、氨基载体上海因酶的固定化酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。
反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。
五、黑曲霉果胶酯酶固定化1、游离酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kerte钮， 1937 )测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑桶果胶溶液于 40 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到 4 .4，加入lmL 酶液(稀释 10 倍) ，同时开始记时。
果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人 O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在4 .4。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应5min ，以加人的NaOH 的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1 个酶活单位 :40 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即PE 活力单位是μmol/min 。
2、固定化酶活力的测定J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kertesz , 1937) 测定果胶醋酶的活力。
取100mL 质量分数为 0.5% 的柑情果胶溶液于 45 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到固定化果胶醋酶的最适 pH( 明胶固定化果胶醋酶为 4.0 、蛋壳固定化果胶醋酶为 4.2) ，加人一定量的固定化果胶醋酶(明胶固定化果胶醋酶为 8g 、蛋壳固定化果胶醋酶为 1g) ，同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在固定化果胶醋酶的最适 pH 。
每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应 5min ，以加人的 NaOH 的微摩尔数反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。
1个酶活单位: 45 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE 活力单位是μmol/min。
3、固定化酶的制作方法蛋壳固定化酶的制作方法蛋壳的预处理取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。
用去离子水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于干燥箱内 60 °C干燥数小时，研成小颗粒，待用。
蛋壳的酸处理称取与预处理好的蛋壳于100mL 烧杯中，向其中缓慢加人 50mL pH = 1. 0 的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理 24h ，最终pH =4 。
固定化酶的制备称取 1g 酸处理后干燥的蛋壳，加入 9mL 乙酸-乙酸铀 (pH = 4.5) 缓冲液，再加入稀释 10 倍的黑由霉果胶醋酶 lmL( 酶活力60U) ，在 4°C (冰水温合物中)搅拌 2-3 h，使其充分吸附在蛋壳上。
之后对其进行离心 (4 °C , 5000*g , 20min) ，得到的离心沉淀产物即为固定化果胶醋酶，用乙酸一乙酸铀 (pH4.5 )缓冲液洗涤数次，放在冰箱中 (4 °C)保存备用。