程辉辉 实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
最新实验3重金属对鱼肝脏过氧化氢酶-精品课件
（3）蛋白质含量测定： 1、标准曲线绘制：以1mg/mL牛血清白蛋白为标准蛋 白。取六支试管，按下表加入试剂。充分混合1min后 ，在595nm处测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标， A595为纵坐标，绘制标准曲线。
试管编号 0
牛血清白 蛋白（μl）
0
蛋白质显 色液 （mL）
（2）活性测定： 在室温条件下，用紫外分光光度计测定过氧化氢酶活
性。参比池为0.01mL 酶样 + 3.0mL 磷酸缓冲液，以此 调零。样品池为0.01mL酶样 +3.0mL 反应液，混合后迅 速放入槽中，盖上盖子。当吸光值开始明显下降的时候， 按动秒表，同时记录当时的数值，随后每10sec 读取一 次数值，连续记录1min。分别测定对照组和污染组金鱼 肝脏过氧化氢酶活性。
三、 实验步骤
（1）组织处理 1、取样：每组取一条重金属染毒后的金鱼，记录污染 物和浓度，解剖，取出肝脏，用双蒸水洗净，擦干。 若肝脏难以识别，取整个内脏团。 2、匀浆：按1g 肝重加12.5mL 匀浆缓冲液的比例加入 缓冲液，在冰水浴（4℃）下用玻璃匀浆器匀浆，匀浆 过程始终保持冰浴，尽可能彻底。 3、离心：将匀浆液移入离心管离心，转速5000g，时 间10min，所得上清液用于过氧化氢酶活性测定。
100S内使H2O2分解一半时的酶蛋白含量。因此，酶 活性单位与一级反应的半衰期有关，半衰期=ln2/K， 半衰期与酶活性关系为：
Activity（Unit）=100（s）/半衰期=100K/ln2 用紫外分光光度计测定H2O2在0~60s内不同时刻的 吸光度A240，求得lnA240-t直线的斜率，即为反应速度 常数K。
由于不同酶样蛋白质含量不同，得到的酶活性必须用 蛋白质含量校正：
程辉辉 感染累枝虫黄颡鱼在患病和痊愈状态下血液生化指标的对比分析
结果分析
实验结论
累枝虫寄生于黄颡鱼可引起鱼体 显著的应激反应，导致鱼体非特 异性免疫能力降低。但治疗痊愈 后，黄颡鱼的非特异性免疫力得 到恢复，鱼体应激反应减弱并表 现出正常的游泳行为。
请各位老师同学 批评指正
患病状态 痊愈状态
皮质醇浓度值（ng/ml）
葡萄糖含量（mmol/L） 酸性磷酸酶活力(King/100ml） 碱性磷酸酶活力(King/100ml） 乳酸脱氢酶活性（U/L） 乳酸含量（mmol/L） 谷草转氨酶活力(U/L) 谷丙转氨酶活力(U/L)
79.27±16.07a
11.25±1.31a 52.45±7.14a 2.58±0.29a 315.40±53.13a 3.07±0.59a 13.32±2.96a 1.42±0.15a
实验设计
实验 结果
寄寄寄 生生生 于于于 头胸背 顶鳍鳍 皮硬硬 肤棘棘 的的的 累累累 枝枝枝 虫虫虫 包包包 囊囊囊
A.
(a), (b), (c)
B. 寄 生 于 下 颌 皮 肤 的 累 枝 虫 包 囊 (d)
C.10×10 显 微 镜 下 累 枝 虫
D. 痊 愈 黄 颡 鱼
黄颡鱼累枝虫患病状态和痊愈状态下血液生化指标的比较（N=10）
研究意义
• 本实验过程中发现累枝虫可感染1龄黄颡鱼成鱼。 • 关于黄颡鱼感染累枝虫后其生理机能变化的研究 ，目前国内外尚无文献报道。 • 血液指标多数用于病鱼和健康鱼的对比分析，并 未对鱼病进行诊治使其恢复健康。 • 黄颡鱼感染累枝虫病后的生理机能变化的研究为 黄颡鱼寄生虫疾病的诊断和治疗提供科学依据。
感染累枝虫黄颡鱼在患病和痊愈状态下 血液生化指标的对比分析
汇报人：程辉辉 导师：李大鹏
风味鱼中过氧化值和酸价的测定
一、 取样方法称取0.5kg 含油脂较多的试样，面包、饼干等含脂肪少的试样取1.0kg ，然后用对角线取四分之二或六分之二或根据试样情况取有代表性试样，在玻璃乳钵中研碎，混合均匀后放置广口瓶内保存于冰箱中。
二、 试样处理1、含油脂高的试样，如桃酥等：称取混合均匀的试样50g ，置于250ml 具塞锥形瓶中，加50ml 石油醚（沸程：30℃~60℃），放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，得到油脂供测定酸价、过氧化值用。
2、含油脂中等的试样，如蛋糕、江米条等：称取混合均匀后的试样100g 左右，置于500ml 具塞锥形瓶中，加100ml~200ml 石油醚，以下按1自“放置过夜”起依法操作。
3、含油脂少的试样，如面包、饼干等：称取混合均匀后的试样250~300g 于500ml 具塞锥形瓶中，加入适量石油醚浸泡试样，以下按1自“放置过夜”起依法操作。
三、原理油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。
三、 试剂饱和碘化钾溶液：称取14g 碘化钾，加10ml 水溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮与棕色瓶中。
三氯甲烷-冰乙酸混合液：量取40ml 三氯甲烷，加60ml 冰乙酸，混匀。
硫代硫酸钠标准滴定液〔c （Na2S2O3）=0.0020mol/L 〕。
定粉指示剂（10/L ）：称取可溶性定粉0.50g ，加少许水，调成糊状，倒入50ml 沸水中调匀，煮沸。
临时用时现配。
四、 分析步骤称取2.00~3.00g 混匀（必要时过滤）的试样，置于250ml 碘瓶中，加30ml 三氯甲烷-冰乙酸混合液，使试样完全溶解。
加入1.00ml 碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5min ，然后在暗处放置3min 。
取出加100ml 水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定液（0.0020mol/L ）滴定，至淡黄色时，加1ml 定粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，取相同量三氯甲烷-冰乙酸、碘化钾溶液、水，按同一方法，做试剂空白实验。
程辉辉 实验报告1：鱼类采血技术
实验报告1：鱼类采血技术学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.7 摘要：血液的生理生化特性是动物对生存环境的适应性反映，也是动物长期进化的结果，因此鱼类的采血技术和一些常规的血液生理生化指标测定是鱼类相关实验研究中的基础。
在鱼类血液相关指标的测定过程中，不同的取血方法对后续血液生理生化指标测定影响很大。
本实验主要学习鱼类尾动脉采血技术和一些基础血液学操作如红比容的测定、血细胞的计数以及血液涂片的观察和血液渗透压的测定。
本实验主要通过采集鲫鱼血液，测定其红细胞比容和血浆渗透压以了解血液组成特性和物理特性，计数其红细胞数目以了解血液中红细胞的数量，观察血涂片以了解血细胞形态。
关键词：鱼类；采血；红细胞比容；血涂片；血细胞计数；血浆渗透压【前言】血液作为动物体内循环系统的重要组成部分，除行使运输功能为身体各个细胞输送养分带走代谢废物外，对机体还具有体内防御、免疫、体液调节以及维持内环境稳定的作用。
因此鱼类的血液生理生化指标的测定是对鱼类生理机能最直观的反应，鱼类血液生理实验也成为了鱼类研究中最常规和最重要的环节之一。
鱼类的血液由红细胞、白细胞和血小板组成，其中红细胞数量最多。
作为机体自稳态系统，鱼类血液中的血细胞数目和形态一般保持着相对稳定的状态。
一旦平衡被打破，必定引起血液中的血细胞数目和形态等发生变化。
因此，血细胞数量和形态的的变化在某种程度上能反映出机体生理或者病理状态的变化。
在血液学研究中，在宏观上，可通过血细胞比容的测定衡量血液细胞组成的变化；在微观上，可通过血细胞计数来衡量血液细胞数目的变化，并通过血涂片以观察其形态的改变。
此外，血浆蛋白浓度和血浆的渗透压是衡量机体生理状态的重要指标。
血浆渗透压包括晶体渗透压和胶体渗透压，各自在维持渗透压平衡和组织液平衡中起到了重要作用。
【材料与方法】选取均重200g左右的鲫鱼，尾动脉采血6ml左右，分装于肝素钠抗凝管1、2和一个未抗凝的采血管3中，抗凝管1作为血浆管，抗凝管2作为全血管，采血管3作为血清管。
氧化应激的定量评价方法大致分做三类
氧化应激的定量评价方法大致分做三类：1）测定由活性氧修饰的化合物；2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。
而根据氧化应激的物质种类，又可主要分为蛋白质氧化损伤标志物检测、脂质过氧化标志物检测、核酸DNA/RNA损伤检测以及活性氧消除系统酶和抗氧化物质检测等。
检测的方法也是多种多样，化学法、免疫染色、ELISA等等就本人经验，核酸DNA/RNA损伤，如8-OHDG ELISA 等方法是比较可靠的，但是通常损伤较重才可能检测出，而传统MDA等脂质过氧化标志物、各种氧化酶化学检测是比较简便的，但却稳定性很差。
大家能否谈谈自己曾采用的相关方法，并从敏感性、简便性等方面谈谈自己的方法ROS氧化损伤碱基后，碱基不稳定，自己掉下去，可以形成AP site(apurinic/apyrimidinic site or abasic site)，或者损伤的碱基被碱基切除（base excision repair）机制切掉形成中间产物。
AP site一般不直接引起细胞凋亡，但是当量太大而又处在S期DNA复制时，细胞在修复AP site 时形成nick直接激活PARP，或者两条互补链上临近的APsite会导致双链断裂，这样激活ATM等，就会进一步传递信号触发细胞凋亡机制了。
一般活性氧才会损伤DNA，过氧化氢不会氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。
氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素细胞氧化损伤后需证实细胞功能障碍可检测哪些指标啊?1.细胞存活率的测定在细胞氧化损伤过程中,每隔半小时吸取100μL细胞液置于96孔微量滴定板,存活细胞用MTT(噻唑兰,serva)染色法确定.MTT溶于pH7.2PBS(终浓度5g/L),过滤灭菌.每孔加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h,每孔再加入100μL酸性异丙醇(100μL异丙醇中含0.04NHCl),混匀,静置5min后,将96孔滴定板置于酶联免疫检测仪上,于波长570nm处测定每孔光吸收值OD,用不加MTT的细胞孔作本底对照,细胞存活率=([OD]t/[OD]u)×100%,此处[OD]t为经3种处理方式处理过的细胞光吸收值,[OD]u为未经任何处理的细胞的光吸收值.2. 凋亡细胞DNA电泳分析以800g的速度离心收集处理过的细胞,弃上清后悬浮于40μL96%0.2M磷酸氢二钠于4%0.1M柠檬酸的PC缓冲液中(pH7.8)30min;1kg离心5min后将上清转移至0.5mL Eppendorf管,真空浓缩20min;加入3μL0.25%NP-40溶液和3μL RNaseA(1g/L)溶液,在37℃下孵育30min后,再加入3μL 1g/L蛋白酶K,37℃下继续孵育30min,最后加入12μL电泳指示剂溶液(含0.25%溴酚兰,40%蔗糖).将样品小心加入含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶点样孔中,在25V电压下电泳10h,于紫外透射仪上观察电泳结果并拍照保存氧化损伤是引起许多组织细胞凋亡的一个重要机制。
鱼类增养殖学水质的检测实验报告
鱼类增养殖学水质的检测实验报告1. 背景鱼类增养殖是一种重要的养殖方式，但水质对养殖鱼类的生长和生存至关重要。
因此，了解水质的关键指标以及其对养殖鱼类的影响是非常重要的。
本实验旨在通过对鱼类增养殖水体进行水质检测，分析检测结果，并提出相应的改进建议，以提高养殖鱼类的健康和生产性能。
2. 实验目的•检测养殖鱼类水体的关键指标，包括溶解氧、pH值、氨氮、硝酸盐、总磷等。
•分析水质指标与养殖鱼类生长和生存的关系。
•提出相应的改进建议，以改善水质并提高养殖效益。
3. 实验方法3.1 测定溶解氧使用氧电极仪对水体中的溶解氧进行测定。
将仪器测量电极放入水中，待读数稳定后记录。
3.2 测定pH值使用pH计对水体的酸碱度进行测定。
将pH电极浸入水中，待读数稳定后记录。
3.3 测定氨氮使用氨氮试剂盒对水体中的氨氮含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
3.4 测定硝酸盐使用硝酸盐试剂盒对水体中的硝酸盐含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
3.5 测定总磷使用总磷试剂盒对水体中的总磷含量进行测定。
根据试剂盒说明书操作，并记录测定结果。
4. 结果分析通过对水质指标的测定，得到以下实验结果：指标测定结果溶解氧8.2 mg/LpH值7.5氨氮0.2 mg/L硝酸盐10 mg/L总磷0.05 mg/L根据对水质指标的分析，可以得到以下结论：•溶解氧：溶解氧水平正常，有利于鱼类呼吸和生长。
•pH值：水体酸碱度适中，有利于鱼类的消化和免疫系统健康。
•氨氮：低浓度的氨氮对鱼类生长无显著影响，但高浓度的氨氮会导致水质恶化和鱼类健康问题。
•硝酸盐：过高的硝酸盐含量可能导致水体富营养化和鱼类疾病发生。
•总磷：适当的总磷含量有利于鱼类的饲料摄取和生长。
5. 改进建议根据水质指标的分析结果，提出以下改进建议：•加强水体的通气和曝气，以提高溶解氧水平。
•定期监测和调节水体的酸碱度，确保pH值处于适宜范围。
•控制饲料投放量，避免过度喂养和过高的氨氮积累。
急性低氧应激对鲫鱼血液生化指标的影响
superoxide dismutase activity( B) in Carassius auratus
第6期
王雪芹等:急性低氧应激对鲫鱼血液生化指标的影响
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2. 4 血清 SOD 酶活力 由图 3B 可知,鲫鱼血清 SOD 活力在急性低
由图 1 B 可知,急性低氧应激过程中,MetHb 含量呈现先微微上升,后快速下降的变化趋势。 低氧应激 3 h、6 h,MetHb 含量与 0 h 均无显著性 差异( P>0. 05) ,12 h 和 24 h 的 MetHb 含量较 0 h 显著下降,24 h 的 MetHb 含量与 0 h 有极显著差 异( P<0. 01) 。
All Rights Reserved. 随着人们对鲜活水产品需求的日渐增大[1] , 水产动物运输量也不断增大,运输过程中环境胁 迫所引起的水产动物应激反应问题日渐突出,尤 其是长时间运输造成水体的溶氧不断消耗,会引 起鱼类强烈的应激反应甚至死亡。 适宜的溶氧水 平对鱼类的生物活动会起到积极作用,当水体低 氧时,会造成机体血液生化指标的变化,引起鱼类 应激反应[2-3] 。 应 激 作 用 下, 鱼 类 机 体 大 量 分 泌 皮 质 醇 ( COR) ,可调节糖原、脂肪和蛋白质的代谢[4-6] , 加速糖异生,为机体提供能量,对抗应激[7-8] 。 因 此血清 COR 和葡萄糖( GLU) 含量常被作为检测 鱼体应激的敏感指标[9] 。 低氧环境下,鱼体血液 摄取和携带氧气的能力会发生改变,引起血红蛋 白( Hb) 和 高 铁 血 红 蛋 白 ( MetHb ) 等 指 标 的 变 化[10] ;体内热休克蛋白 70( Hsp70) 基因的表达量 会 显 著 上 调[11] , 同 时, 机 体 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD) 等的活力上升,用以清除过量的活性氧自 由基( ROS) [14] ,维持正常的生理活动。 因此,研 究血液相关生化指标的变化,综合评价鱼类在持
营养素中氧化应激水平的测定实验报告
营养素中氧化应激水平的测定实验报告一、引言氧化应激是指机体内氧化还原平衡被打破，导致过多的自由基和氧化物质积累，从而引发一系列有害反应的过程。
氧化应激与许多疾病的发生发展密切相关，如心血管疾病、神经系统疾病和癌症等。
因此，研究氧化应激的水平对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。
营养素在维持氧化还原平衡中起着重要作用。
许多研究表明，适当补充一些特定的营养素可以减轻氧化应激的程度，保护机体免受氧化损伤。
因此，本实验旨在通过测定不同营养素对氧化应激水平的影响，探讨其保护机制，并为人们选择适当的营养素补充方式提供依据。
二、材料与方法1. 实验材料：- 不同营养素：维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、硒等；- 某一氧化应激指标的测定试剂盒；- 实验动物（如小鼠）；- 适当的实验设备：离心机、试管、显微镜等。
2. 实验步骤：此处应列出实验的具体步骤，包括：- 按照一定比例制备不同浓度的营养素溶液；- 随机分为不同实验组和对照组；- 将实验动物分组，分别给予不同营养素溶液；- 收集实验动物的血样或组织样本；- 使用氧化应激指标的测定试剂盒进行相关指标的测定；- 分析实验结果，得出结论。
三、结果与讨论1. 结果分析：- 比较不同实验组和对照组的氧化应激指标水平；- 观察实验动物在给予不同营养素后的体征变化。
2. 结果讨论：- 分析不同营养素对氧化应激水平的影响；- 探讨不同营养素的保护机制。
四、结论通过本实验的结果分析与讨论，我们得出以下结论：1. 维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、硒等营养素对氧化应激水平具有一定的保护作用；2. 维生素C具有较强的抗氧化能力，可以减轻氧化应激引起的损伤；3. 维生素E可以抑制脂质过氧化反应，防止脂质氧化引起的氧化应激；4. β-胡萝卜素和硒等营养素可以通过激活抗氧化酶系统，增强机体的抗氧化能力。
五、结语本实验通过测定不同营养素对氧化应激水平的影响，揭示了营养素在维持氧化还原平衡中的重要作用。
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实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.21
摘要：鱼体在受到外界刺激的时候，组织或细胞内氧自由基生成增加，清除能力降低，导致活性氧在组织或细胞内蓄积而引起氧化损伤。
而活性氧的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化。
蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。
而衡量脂质过氧化的指标便是丙二醛，其是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标。
在本实验中，我们主要探究了脂质过氧化和蛋白羰基化的测定方法，以便更好的定量衡量氧化应激的程度。
实验中所测得的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot，肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA 含量为0.14 nmol/mg prot，相比其他的实验，所测定结果相差较大。
在实验中存在诸多操作失误，希望能在以后的实验中引以为戒，为实验室条件下对鱼类的氧化应激水平奠定实验和操作基础。
关键词：应激；蛋白质定量；蛋白质羰基化；脂质过氧化
【前言】
随着集约化养殖的发展，鱼类在养殖过程中遭受到的应激因素日益增多。
人为活动、外界环境的变化、饵料和水体中的有害物质均会对鱼体产生应激。
氧化应激反应是有氧生物不可避免的，它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。
ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。
自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。
线粒体呼吸是ROS 主要的内源性来源（李学彬，2009）。
ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。
在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸。
不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。
这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。
丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度（刘淑兰，2012）。
脂质过氧化的测定通常是通过TBA试验来完成的，其主要应用于食品和生物材料中脂类氧化检测和定量。
硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛（MDA），MDA 与硫代巴比妥酸（TBA）作用生成TBA染料配合物，此化合物在532nm 下有最大吸收值。
通常测试结果表示为532nm下吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说TBA值。
蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。
蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。
蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统（MCO系统)完成的。
在这个过程中，Fe2+和Cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。
被H2O2或O2攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化（曹溪青，1985）。
此外, 羟自由基也可直接作用于肽链, 使肽链断裂, 引起蛋白质一级结构的破坏, 在断裂处产生羰基。
目前，大量的研究证明了氧化损伤与衰老和疾病的关系。
实验中采用的蛋白质羰基化的测定方法是2, 4 -二硝基苯肼（DNPH)比色法，这
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是一种是测定蛋白质羰基含量的经典方法。
被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2,4-二硝基苯肼（DNPH ）反应生成红棕色沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后即可读取370nm 下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。
【材料与方法】
选取均重200g 左右的鲫鱼，解剖鱼体，暴露内脏，切离部分肝脏和肌肉组织，然后将其转入玻璃匀浆器中，按照1:9（W/V ）比例加入PBS （匀浆介质），充分研磨均匀，制成组织匀浆液（冰水浴中进行）。
1.匀浆蛋白浓度测定
取约0.5g 组织样品，以1:9比例加入PBS 进行研磨得到组织匀浆。
取组织匀浆
上清稀释十倍后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。
2.脂质过氧化测定
• 将MDA 标准品浓度（10 nmol/mL ）稀释到0,1,2.5,5,7.5,10 nmol/mL ；
• 取0.2 mL 稀释40倍的未离心的匀浆液和不同浓度的MDA 标准品，分别与0.8 mL 的0.53% TBA 混匀，于95℃孵育60 min ，4℃15000 g 离心15 min ，取上清，测定532 nm 处的吸光值（一定要保证管口的密封性）
• 以MDA 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到MDA 浓度与吸光值关系的公式。
• 以样品吸光值带入上述公式，计算样品中的MDA 浓度为C MDA （nmol/mL ） • 组织中MDA 含量（nmol/mg prot ）=[C MDA (nmol/mL)]/[Protein mg/ml]
3.组织蛋白质羰基化测定
• 取稀释后的上清50μL ，在上清中加入50μL 的10mmol/L 的DNPH 作为试验管，另取稀释后上清50μL ，加入50μL 的2.5mmol/L 的HCI 作为空白管。
• 将各管置于冰盒中避光放置1h ，每隔15min 涡旋振荡混匀一次。
• 反应完后加入25μL 50%（W/V ）的三氯乙酸（TCA ）溶液来沉淀蛋白质衍生物，4℃ 12000g 离心15min ，弃上清。
沉淀用200μL 乙醇和乙酸乙酯的混合物（V ：V=1:1）洗涤（4℃ 12000g 离心15min ），最后沉淀用400μL6mol/L 盐酸胍溶解（37℃，15min ）。
之后于12000g 离心15min ，取上清，测定370nm 处吸光值。
• 计算：羰基浓度（nmol/mL ）=[CA/22000]×106×(V final / V sample )
• CA=实验组吸光值-对照组吸光值
V final 是指终体系的体积；V sample 是指所加入的样品体积
蛋白质浓度（nmol/mg protein ）=(Carbonyl nmol/ml)/(Protein mg/ml)
【实验结果与分析】
1.匀浆蛋白浓度的测定结果
羰基MDA
肝脏肌肉肝脏肌肉OD值0.5337 0.4809 0.51685 0.5744
蛋白浓度(mg/ml)46.95 22.48 39.14 65.82 根据以上标准曲线，本组所测定的蛋白质羰基测定过程中肝脏蛋白浓度为46.95mg/ml，肌肉蛋白浓度为22.48mg/ml，MDA测定过程中肝脏蛋白浓度为39.14mg/ml，肌肉蛋白浓度为65.82mg/ml。
2.MDA的测定
本组所测定的肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA含量为0.14 nmol/mg prot。
3.蛋白质羰基化的测定
本组所测定的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot。
【讨论】
实验过程中测定的脂质过氧化所产生的MDA含量与复合污染条件下鲫鱼组织脂质过氧化中肝脏MDA含量（1.18~1.59nmol/mg prot）（贾秀英，2003）及亚硝酸盐胁迫条件下鲫鱼肝胰脏组织MDA含量（1.18±0.24nmol/mg prot）（谭树华，2005）相对比，结果的差异性较大，可以认为本次测定结果为错误，主要是因为测定过程中，测定的步骤与蛋白质羰基化的步骤混杂，且操作的过程不规范，因此造成了实验结果的错误。
蛋白质羰基含量测定结果与镉胁迫条件下瓯江彩鲤脏器组织蛋白质羰基含量（0.68-2.07nmol/mg prot）（刘晓旭，2011）相差太大，可以认为此次实验的结果不可靠。
两次的实验过程中，我们所测定的结果发生错误原因很多：第一，操作的过程不规范，如避光处理并未达到避光的要求；第二，实验步骤混乱，两个实验并行穿插以后，实验的步骤显得十分的混乱；第三，对实验过程的把握程度不够，故而造成了上述的结果，希望能在以后的实验中引以为戒。
参考文献：
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