哺乳动物精子质量检测的原理及应用
肉牛精液品质检查与冷冻保存
肉牛精液品质检查与冷冻保存一、人工授精的意义人工授精是家畜繁殖技术的重大突破和革新，已在世界范围内推广使用，近些年来在经济动物和渔业中也得以扩展，充分显示出其发展潜力和前景。
（一）人工授精能充分发挥优良种公畜的种用价值和配种效能一头优秀种公牛采用人工授精技术每年能使万头以上母牛受孕，使优秀种牛的基因得以固定和充分利用。
（二）提高母畜的受胎率人工授精使用经严格处理的优质精液，每次输精的时间经过科学的判断，输精部位准确，故受胎率高。
（三）由于公母畜不直接接触，可防止疾病特别是生殖道传染病的传播。
（四）能克服杂交改良时由于公母畜体重差异悬殊造成的配种困难。
（五）采取冷冻精液技术，使人工授精可以不受国家和地区的限制，同时也加快了育种工作步伐。
（六）降低饲养管理费用由于每头种公畜可配的母畜数增多，相应减少了饲养公畜的头数，降低了饲养管理费用。
（七）是推广繁殖新技术的一项基础措施如家畜繁殖控制技术、胚胎移植等都需要借助人工授精技术。
二、精液品质检查精液品质检查的目的是鉴定精液品质的优劣，以便确定配种负荷；反映公牛的饲养管理水平和种用价值；检验精液稀释、保存和运输效果。
检查精液品质时，要对精液进行编号，将采得的精液迅速置于30℃的温水中，防止低温打击。
检查要迅速、准确，取样有代表性。
（一）、精液外观性状检查1.采精量采精后即可测出精液量的多少。
牛的射精量为5-10毫升，范围为0.5-14毫升。
精液量差异，应及时查明原因，及时调整或治疗。
2.颜色精液一般为乳白色或灰白色，精子密度越大，精液的颜色越深。
牛的精液呈乳白色，有时呈淡黄色。
如果精液颜色异常属不正常现象。
若精液呈红色说明混有鲜血；精液呈褐色很可能混有陈血；精液呈淡黄色则是混有脓汁或尿液。
颜色异常的精液应废弃，立即停止采精，查明原因及时治疗。
3.气味正常精液略带有腥味，牛精液除具有腥味外，另有微汗脂味。
气味异常常伴有颜色的变化。
4.云雾状牛的精液精子密度大，放在玻璃容器中观察，精液呈上下翻滚状态，象云雾一样。
哺乳动物的精子获能及其鉴定
配母畜的子宫 内取 出精子用于受精 ，以受精率为指 Ｂ Ａ、ＷＷ、Ｏ等 培养 液 进 行 哺乳 动物 精 子 获 能培 Ｓ Ｂ Ｂ
标， 分析 获能 的部 位 、 时程及其 机制［ 进一 步研究 发 养 均见 报道 。 目前 ， ３ １ 。 常用 的为 Ｂ Ｏ液 和改 良的 Ｔｒｏ ｙｄｅ 现 ， 能过程 没有 种 的特 异性 ， 获 即精 子不 仅在 同种 生 液 （Ａ Ｐ 两 大 类 。许 多 哺 乳 动物 ， 鼠 、 、 、 ＴＬ） 如 牛 猴 马 殖 道 内 ，而且 可 以在 异种 动物 生殖 道 内或 液体 内进 等 ， 其精 子体外 获能 的研 究越 来越 多。近年来 的研究
培养 基获得 体外 受精 成功 以来 ，分 析体外 精 子获 能
精子 获能 的方法分 为体 内获能和体外 获能两种 。 能 。 自从 Ｔｙｄ 等 最先报 道 了采用 一种特 定 的化学 ｏｏａ １ 体 内获能 ． １ 早 期 的获能研 究 ， 用体 内获 能 的方 法 ， 采 即从 交 已成 为 比较容 易 的事 情【 ５ ＿ Ｔｒｄ 、 Ｒ Ｈ ｍＦＯ 。以 ｙｏｅＫ Ｂ、 ａ ｌ 、
经 上浮 法处理 可获 得活 力较 强 的精子 ，但 精子
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
黑龙江动物 繁殖
第 １ ８卷
第 ２期
２１ ０ ０年
回收率较低 ，目前该方法已成为牛精子 （ 尤其是冻 剧 地 前 向运 动 （ 穿 梭 运 动 ）和 鞭 打 样 运 动 ［ 或 ３ １ 。 精） 洗涤与体外获能的主要方法 ； 精子沉淀加上游法 Ｙ ｎｇ ａｈ 于 １７ 年首先在仓 鼠精子获能时观察 ａａ ｃｉ ９０ ￣ ｍ
外授精研 究取得 了突破 性进展 ， 为人 类研 究受精机 理 奠定 了基础 。本 文从体 内、 体外 两方 面论述 了
哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展
作者简介 ：陈军 （９ ８一） １７ ，男 ，四川 人 ，硕士 ，畜牧
师 ，主要 从 事 畜 牧 技 术 推 广 与 应 用 。
Ｅ—ｍ ｉ： ｕ ｃ ｅ ０ ＠ １ ３ ｃ ｍ ａ ｊｎｈｎ ８ ６ ． ｏ ｌ
测精 子 顶 体 反 应 ，不 仅 可 以分 析 精 子 群 体 Ａ Ｒ状态 ，而 且 可判 断精 子是 强 烈 的活 动还
展进行概述 。
１ 精 子 顶体 结构
丘细胞 时 ，先是顶体 外膜 向顶 体基 质 凹人 形
成小泡 ，以后再 失去质膜 Ｊ 。顶 体反应 是受 精过程 中极其重 要 的环节 ，只有发 生顶体 反 应 的精子 才能与卵子结合 。
３ 顶 体 反 应 检 测
哺乳动物精子顶体 是一个 膜结合 的帽状 结构 ，它覆盖在精 子核 的前面 。顶体 由位 于 前 面的顶体 帽和位 于后 面的赤道板 两部分 组
Ａ ” 染 色法检测 包括人 、牛 、猪 、兔 和小 鼠等精 光 区带 ；“ Ｒ 型精子 ，顶体 帽缺失 ，整个
子的 Ａ Ｒ，并 采用 经典 的荧 光 亲 和 技术 Ｐ Ａ 精 子 头 部 显 示 淡 绿 色 或 无 荧 光 。 近 年 来 ， Ｓ 法证 明其 可靠性 。考马斯亮 蓝是常 用 的蛋 白 Ｃ Ｃ技术越来越受 到人们 的青睐 ，已广泛应 Ｔ
陈 军 ，韩 东 ，曾 黎 ，程相鲁
（ 疆 畜 牧 总 站 ，新疆 乌 鲁 木 齐 ８ ００ ） 新 ３０ ９
中图分 类号 ：￥ １ ８４
文献 标识 码 ：Ａ
文章 编号 ：１ ０ ２ ３ （ ０ ２ ０ ０ ０ ０ ０ ５— ７ ９ ２ １ ） ５— ０ １— ４
精子顶体反应检 测有助 于更准确 评价 精 体 外 膜 （ Ａ ，贴 近 核 膜 的 是 顶 体 内 膜 Ｏ Ｍ） ＩＭ） 。二膜之 间的基 质 中含着 精子 完成 液 品质 ，达 到提 高受精率 的 目的。依 据精 子 （Ａ Ｊ
任务五 家畜精液品质检查
（3）保护剂
★缓冲物质：精子在体外不断进行代谢，随着代谢产物(乳 酸和CO2等)的累积，精液的pH逐渐下降，甚至会发生酸中毒 ，使精子不可逆地失去活力。因此，有必要向精液中添加一定 量的缓冲物质，以平衡酸碱度。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、酒 石酸钾钠、磷酸二氢钾等。近些年，生产单位采用三羟甲基氨 基甲烷(Tris)作为缓冲剂，效果较理想。
吸入！
共有两个对 称的计数室
用移液器注入精液
（4）精子计数
• 将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到 计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。
• 计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的 头部为准，依数上不数下，数左右不数右的原则进行计 数格线上的精子。
进行精子计数 的中方格数可 以是四角一中 心共5个中方格
2、稀释液的成分及作用
（1）稀释剂 ：稀释剂主要用以扩大精液容量，要
求所选用的药液必须与精液具有相同的渗透压。严格地讲， 凡向精液中添加的稀释液都具有扩大精液容量的作用，均属 稀释剂的范畴，但各种物质添加各有其主要作用，一般用来 单纯扩大精液量的物质有等渗的氯化钠、葡萄糖、蔗糖溶液 等。
（2）营养剂 ： 主要为精子体外代谢提供养分，补
1、动物精液的精子密度
畜种
牛
羊
猪
密度 亿/ml 8-12 20-30 2-3
马 1.5-3
鸡 30-50
40 30 20 10
0 牛羊猪马鸡
亿/ml
估测法：稠密、中等、稀疏
• 稠密：每毫升精液中精子数约在10亿以上； • 中等：每毫升精液中精子数约在2--10亿之间； • 稀疏：每毫升精液中精子数约在2亿以下。
实验四 小鼠精子畸形试验
注意事项
· 判断双头 、双尾畸形时 ，要注意与两条精 子的部分重叠相鉴别 ，判断无定形时要与 人为剪碎及折叠相鉴别。
· 使用的小鼠要健康 ， 以免感染 、体温增高 等可能导致精子畸形率增高 ，造成假阳性 结果。
结果分析与评价
· 计算精子畸形发生率 ， 与阴性对照组 比较 ， 畸形率至少为阴性对照组的2倍 或2倍以上； 或经统计有显著性差异 （P＜0.01） ，并有剂量反应关系。
· 待玻片晾干后用甲醇固定5分钟 ，干燥。
镜检
· 先用低倍镜粗检 ， 找到背景清晰 、精子重叠 较少的部位 ， 用高倍镜检查精子形态 。每只 小鼠检查精子1000条。
· 精子畸形： 主要在头部 ， 其次为尾部 。畸形 类型可分为无钩 、香蕉形 、双头 、胖头 、无 定形 、尾折叠 、双尾等。
· 分别记录异常类型和数量 ， 以便统计精子畸 形率及精子畸形类型的构成比。
实验四 小鼠精子畸形试验
目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物能 否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方 法 。通过该实验 ， 学习和掌握小鼠精子 畸形试验的原理和步骤。
理
· 小鼠精子畸形受基因控制 ， 具有高度遗传性， 许多常染色体及X 、Y性染色体基因直接或间 接地决定精子形态。
· 精子的畸形主要是指形态的异常 ， 是决定精 子形成的基因发生突变的结果 。因此形态的 改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。
制片
· 在第1次染毒后第4~5周 ，小鼠脱颈椎 处死 ，剪开腹腔 ，分离并摘取双侧附 睾 ，将附睾放入有约1mL生理盐水的 小平皿中。
制片
· 用眼科剪将附睾纵向剪1~2刀 ， 用吸管将悬 浮液轻轻吹打5-6次 ，静置3-5min；
· 用4层擦镜纸过滤除组织碎片 ， 用胶头滴管 吸取精子悬液 ， 滴一滴于清洁载玻片上， 均匀推片；
某种动物的精子质量评价与提升方法研究
某种动物的精子质量评价与提升方法研究某种动物的精子质量评价与提升方法研究引言：动物的繁殖能力对于物种的生存和发展至关重要，而动物的繁殖能力又与其精子质量密切相关。
精子质量的好坏直接影响着受精率和胚胎发育的成功率。
因此，对某种动物的精子质量进行评价与提升方法的研究具有重要的理论和实践意义。
一、精子质量的评价方法1. 精子密度：精子密度是指单位体积内所含精子的数量，可以通过显微镜观察精液中的精子数量来进行评价。
2. 精子活力：精子活力是指精子的运动能力，一般通过显微镜观察精子的游动速度和活跃程度来评价。
3. 精子形态：精子形态是指精子的形状和结构，可以通过显微镜观察精子的形态是否正常来进行评价。
4. 精子浓度：精子浓度是指单位体积内所含精子的浓度，可以通过显微镜观察精液的稀释倍数来评价。
二、精子质量的提升方法1. 饮食调控：合理的饮食可以提高动物体内的营养物质含量，从而提高精子的质量。
例如，增加富含蛋白质、维生素和矿物质的食物摄入量，可以提高精子的活力和数量。
2. 环境管理：良好的环境可以减少动物的压力和疾病感染，从而提高精子的质量。
例如，保持适宜的温度和湿度，减少噪音和振动等对动物的干扰，可以提高精子的活力和形态。
3. 遗传改良：通过选择优良的个体进行繁殖，可以逐渐提高种群的精子质量。
例如，选择具有高精子密度、活力和形态的个体进行繁殖，可以逐渐提高后代的精子质量。
4. 药物干预：一些药物可以提高动物体内的激素水平，从而促进精子的生成和发育，提高精子的质量。
例如，使用促性腺激素类药物可以增加精子的数量和活力。
5. 精液处理：通过精液的离心、稀释和冷冻等处理方法，可以提高精子的存活率和质量。
例如，离心可以去除精液中的杂质，稀释可以调整精子浓度，冷冻可以延长精子的保存时间。
结论：对某种动物的精子质量进行评价与提升方法的研究，可以为该物种的繁殖工作提供科学依据和技术支持。
通过合理的饮食调控、环境管理、遗传改良、药物干预和精液处理等方法，可以提高精子的密度、活力和形态，从而提高动物的繁殖能力和繁殖效益。
哺乳动物精子获能及其鉴定
哺乳动物精子获能以及鉴定摘要：精子获能是精卵结合的前提，是哺乳动物受精过程中的关键环节。
精子获能的发现促使体外授精研究取得了突破性进展，为人类研究受精机理奠定了基础。
本文从体内、体外两方面论述了哺乳动物精子获能的培养方法，并且对精子获能的评价方法进行了总结。
关键词：精子获能；培养；评价人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能立即与卵子受精，它必须经历一系列生理生化及形态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为获能（capacitation）。
精子获能是精子受精前必须经历的一个生理阶段。
自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最后完成于输卵管壶腹部。
研究表明，精子获能不仅可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当的培养条件下进行。
1 精子获能的方法精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。
1.1 体内获能早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指标，分析获能的部位、时程及其机制。
进一步研究发现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进行获能。
将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养同样能使精子获能。
精子在成熟过程中，表面被覆了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有抑制作用。
在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运动时，子宫颈黏液输卵管液和卵泡液，以及输卵管上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促进获能的发生由于体内获能的研究，经常受到许多条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内，特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获能的因子，对于复杂的体内环境人们又很难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难为此，体外获能的研究方法应运而生。
【doc】常用哺乳动物精子质量检测方法
常用哺乳动物精子质量检测方法经济动物2004,8(4):198～201,204JournalofEconomicAnimal常用哺乳动物精子质量检测方法'田恒玖,刘志平,白玉妍(东北林业大学野生动物资源学院,哈尔滨150040)摘要:根据精子的特性,利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪等仪器,结合常规染色技术或荧光探针技术,通过检测精子染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态,以便准确预测精子的受精能力.关键词:精子:顶体;获能;线粒体;精子质量中图分类号:$814.8文献标识码:A文章编号:1007—7448(2004)04—0198—04 TheMethodsoftenUsedforEvaluatingtheMammalianSpermQuality TINAHeng—jiu,LIUZhi—ping,BAIYu—yan(CollegeofWild.elifeResources,NortheastForestryUnivers,Harbin150040,China) Abstract:Inordertoaccuratelypredictspermfertilizingpotential,spermqualityisestimatedt houghchromatinstructure,motility,integatyofplasmamembrane,acrosomalstatus,mitoehondria activity,Ca—pacitation,acrosomereactionandbindingooc~emainlybylightmicroscopy,fluorescentmic roscopyorflowc)rt0metrycombiningwithclassicstainingorfluorescentprobetechnology.. Keywords:spermatozoa;acrosome;capacitation;mitoehodfia;spermquality随着人工授精和体外受精技术的不断发展,以及这些技术在生产实践中的应用,如各种哺乳动物的繁育,濒危野生动物的拯救,人类不孕症的解决等,使得精子质量的评价方法也在不断改善.客观,准确的评价精子的功能状态,对于科研和生产实践具有重要的意义.它不仅可以预测雄性动物的繁殖力,而且可以节约精子的用量,使雄性动物的遗传资源得到充分利用,优良的基因得到最广泛传播.评价精液质量的目的就是要快速准确地预测精子的受精能力.在过去的几十年里,主要是通过光学显微镜来评价精子的常规指标,如精液量,精子的密度,精子的运动能力,形态和活力等.这些方法虽然比较简单,但准确性不高.随着生物学的不断发展,精子质量的评价方法不断被改进.现在主要是利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪(flowcytometry)等仪器,应用常规染色技术或荧光染色技术来分析精子的功能状态.评价的指标主要是染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等.这些方法是现在实验室和生产中常用的方法,下面对这些方法进行简单概述.1染色质的结构许多因素可以导致畸形精子的产生,如各种有毒的药剂以及阴囊内温度的偏差等.异常染色质的结构会导致精子的核材料在包装过程中产生差错,这可能与畸形精子的产生有关.牛精子不基金项目:农业科技成果转化资金项目资助(020～413218)作者简介:田恒玖(1978.).男,在读硕士,主要从事野生动物繁殖研究. 收稿日期:2004.08.28第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法正常的染色质结构与精子核的形态之间就有着重要的联系.但在光学显微镜下,通过视觉检查精子的形态并区分精子是否正常,所得的畸形精子数要低于染色质结构试验所得的结果.畸形精子的染色质结构,可以通过染色质结构试验来评价(SCSA).因为DNA的变性位点具有感光性,用异源性的染料吖啶桔(AO)染色,通过流式细胞记数仪,可以看到插入没变性的双链DNA的AO染料发绿色荧光,而与变性的单链DNA结合的AO染料发红色荧光.用SCSA来确定DNA的变性程度,可以准确的预测各种雄性动物精子的受精能力包括人类的精子'.与显微镜观察作比较,SCSA是一种比较灵敏的试验.Karabinus等的研究表明,与阴囊隔离3d的荷斯坦牛的精子经过加热处理后,就可以观测到其染色质结构的变化,而用光学显微镜观察要等到隔离lld后.2质膜的完整性精子的质膜是最易损伤的部位.功能完整的质膜是精子能够新陈代谢,完成获能和顶体反应,以及与透明带(ZP)结合并穿过ZP的基础.在过去的几十年间,人们就已经意识到精子的质膜功能是否完整是区分精子死活的一个重要特征.因而在此基础上发展了许多评价精子质量的方法.2.1常规染色法由于活精子的质膜是完整的,所以不易被台盼兰(typanblue),碘化丙锭(PI)等染料染色.用这些染料来孵育精子,可以使死精子着色,而活精子不着色或只吸收了少量的染料.一些复合的染料像台盼兰一吉姆萨(trypanblue—giemsa),伊红一苯胺蓝(eosin—anilineblue)以及其他一些常规的染料被广泛的用来区分精子的死活.这些染料通常只能为新鲜的精液染色,而冷冻的精液中含有甘油,会影响这些染料的作用.所以,现在常用荧光染料来对冷冻精液进行染色,用荧光显微镜或流式细胞记数仪来分析精子质膜的完整性.用流式细胞记数仪进行评价,可在很短时间内检测大量的精子,比用荧光显微镜检查快得多,但该方法耗资较高,限制了其在实际中的应用.2.2荧光探针染色法荧光探针染色技术的发展,为评价精子的功能状态提供了新的工具.单一或复合的荧光探针都可以被用来评价精子质膜的完整性.使用最多的核酸荧光探针是Hoechst33258(H258),Hoechst33342(H342)以及菲啶类染料,如溴化乙锭(EtBr),碘化丙锭(PI)和溴乙菲啶二聚体(EthD.1).这些染料对于质膜完整的精子不具有渗透性,因此,他们被用来作为死精子的标记,并且在多种荧光染料结合分析时作为对比染料. H258被广泛用来进行核的体外活体染色,现已应用于人类,山羊,绵羊,牛,猪等动物.H258,H342非常适用于多种染料混合时的标记试验.通常这两种染料与具有更长发射波长的染料结合使用. 但H258,H342对于质膜完整的精子具有半渗透性,并且具有广泛的发射光谱易与其他染料的发射光谱重叠,所以在与其他染料结合使用时需要使用过滤器.另外,紫外光对精子和分析人员还具有损害作用.因此在实际中,这些染料不被经常使用.精子的质量也可以用各种双重荧光标记来评价,如用非特异性酯酶基质羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)或钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)与没有膜渗透性的核酸染料结合使用.这两种探针结合使用不但可以测定出精子活力的2个参数——精子内酯酶的活性以及质膜的完整性,同时还可以测定出精子的死活.现已被用来评价多种动物的精子活力,如牛,羊,猪,马等.目前,一种新的具有膜渗透性的核染料SYBR一14被用于活精子的染色.其只能鉴定活精子,一般要与PI结合起来用以评价精子的活力.这2种探针结合起来使用具有染色速度快,染色稳定等一些优点.另外,这2种染料用可见光就可以激发,避免了用紫外光激发对精子和操作者带来的伤害.在可见光的照射下,与活精子结合的SYBR一14发绿色荧光,而与死精子结合的PI发红色荧光.这2种探针结合使用评价精子的活率非常有效,目前认为,SYBR—l4一PI是最适合于各种动物精子死活鉴定的荧光探针. 2.3低渗肿胀试验精子质膜的功能完整性也可以通过低渗肿胀试验(HOST)来测定.精子的细胞膜允许水分子选择性通过,以使精子内外的渗透压达到平衡.在低渗环境中,水分子通过细胞膜流入精子内,为了达到细胞内外的平衡,质膜完整的精子发生肿经济动物2OO4焦胀.由于质膜的肿胀而使精子的尾部发生弯曲, 这种变化在相差显微镜下就可以很容易观察到, 而质膜不完整的精子没有这种现象发生.因此发生肿胀的精子数越多,精子的质量越好.HOST 简单,迅速,对于检验质膜的完整性非常实用.所以被用于人,狗,牛,羊,猪,小鼠和马等动物精子质膜完整性的检测.3精子膜的去稳定精子膜的去稳定可以通过精子内的ca2分布来评价,目前有两类ca2指示剂.一类主要是金霉素(CTC),它能够在ca2浓度高的细胞器内沉积,并与Ca2结合;另一类主要是一些能够进入细胞液等液体环境内的分子颗粒,这些颗粒与ca2结合后会使他们的光谱发生改变.中性的CTC可以很容易的穿过细胞膜,在那里它可以电离出1个阴离子并与ca2结合成螯合物.ca螯合物易与疏水部位优先结合,如膜部位,并能够使其荧光性增强.由于精子质膜状态的不同,精子的功能状态可以区分为几种不同的染色类型.许多研究者发现,人类,小鼠,牛,猪以及其它一些动物具有相同的CTC染色类型.这些染色类型共有3种:①F型,精子的头部具有相同的荧光,为未获能,顶体完整的精子;②B型,在顶体后区无荧光或有非常弱的荧光,为获能且顶体完整的精子;③AR型,整个精子头部无荧光,只在赤道区域有一条荧光带,为顶体反应的精子.可见,CTC不但可以检测精子获能的比例,还可以检测顶体反应的比例.为了证明精子膜的去稳定以及去稳定的程度与受精力成负相关,已进行了许多研究.现已证明,牛精子中F型的发生率与受精力之间负相关.4线粒体的活性线粒体能够不断产生精子运动所需要的ATP来提供能量,因此,线粒体的功能状态是精子质量的一个关键指标.由于活精子的线粒体上存在着跨膜电位,所以阳离子成分的染料若丹明(Rh123) 能在其上沉积.Rh123的吸收速度快,平衡时间短,对温度依赖性小,而且冲洗时无残留,因此一直与EtBr结合使用来评价精子的线粒体的活性. 用Rh123培养精子,活精子的线粒体鞘会被染成绿色,而死精子可以用EtBr或其他荧光染料来区分.在试验中Rh123并不是十分合适的探针,用其染色时,精子必须用乙醛或其他药剂固定,这会影响线粒体的活性.分子探针可以解决这个问题,如已发展的线粒体示踪探针,可以选择性的对有活性的线粒体进行染色,并且精子固定时线粒体的活性也不受影响.虽然Rh123和线粒体示踪探针可以证明线粒体膜电位的存在,但另一种染料JC一1具有独特的特性,能够区分膜电位的高低.用其染色膜电位高的线粒体发桔红色荧光,膜电位低的线粒体发绿色荧光.这些染料经常被用来研究马,牛,羊,猪和大鼠等动物精子的线粒体功能和活性.研究表明,用荧光法测定线粒体的活性与SYBR一14以及显微观察法之间正相关.5顶体的状态哺乳动物精子的顶体反应是受精过程中非常重要的一个过程.具有完整顶体的精子是受精成功的关键.目前,有2类常规的荧光探针可以评价顶体的状态.一类主要是CTC以及一些与细胞外暴露的抗原结合的抗体;另一类主要是外源植物凝集素及一些与精子内顶体抗原结合的抗体,其中的外源植物凝集素常被用来评价顶体的状态.现在用的最多的是异硫氰荧光素(FITC)与豌豆凝集素(PSA),花生凝集素(PNA)或伴刀豆凝集素(ConA)结合使用.这些凝集素被用来评价人类,马,猪,牛,羊等动物精子的顶体状态.用FITC—PSA,FITC—PNA,FITC—ConA来评价顶体的状态简单,迅速,但不能区分精子的死活.因此在用凝集素进行体外活体染色时,一些荧光性的核染料像H258,PI或EthD一1等也被用来结合使用.Ozaki等用H258和FITC—PSA结合使用来评价人类精子的活力以及顶体反应.染色后用荧光显微镜观察,可以看到4种类型的精子:①活的,顶体完整的精子;②活的,顶体反应的精子;③死的,顶体完整的精子;④死的,顶体反应的精子.通过这种方法可以很容易的评价精子的活力和顶体的状态,对评价精子的受精力有着重要意义.FITC—PSA与PI也经常结合起来使用,同时评价质膜的完整性和顶体的完整性H...对于没有渗透性的精子FITC—PSA能够提供精子顶体完整性的信息:顶体完整的精子没有荧光.顶体缺失第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法或发生顶体反应的精子发绿色荧光.PI可以用来作为死精子的标记.用这两种染料来评价精子的活力和顶体的完整性,对于新鲜的,体内获能的精子非常可靠,但不适用于冷冻精液,因为冷冻精液中有蛋黄颗粒,而影响了分析结果的准确性.为了克服蛋黄颗粒的影响,SzabolcsNagy等研究了一种三重染色技术,他们用SYBR一14/PI与藻红素(PE)花生凝集素的结合染料PE—PNA来同时评价质膜的完整性和顶体的完整性, 并结合流式细胞记数仪来检测,分析结果非常准确,还减少了洗去蛋黄颗粒带来的损伤和不便,是一种非常简单,实用的方法,此法将对哺乳动物精子的低温保存的研究有着重要的影响.6精卵之间的相互关系受精过程的各个步骤以及胚胎发育的情况都可用来评价精子的质量,这些或许能对精液的受精能力提供一些有价值的信息.我们知道一个成功的受精过程包括一系列连续的步骤.即:①精子在雌性生殖道内获能;②获能的精子与zP的结合;③精子顶体反应;④精子穿过ZP;⑤精子与卵子质膜融合.受精过程的一个关键步骤就是精子与ZP的结合能力.由于在动物排卵过程中ZP外的多层基质没有了,ZP就成了精子进入卵子的第一道屏障.获能的精子与ZP以一种十分精确的方式相互作用.大量的研究表明,精子与zP的结合分为2个步骤.第一步精子变疏松并不断地转动与卵子的ZP黏附;第二步精子不再转动而与zP紧密的结合.许多精子都可以与ZP黏附并进入ZP,但只有1个精子能够穿透ZP与卵子质膜融合.在透明带结合试验(ZBA)中,精子与同源zP结合的本质特征已经被用来评价精液的受精能力.实际上在ZBA可以用完整的ZP,也可以用半透明带即半透明带结合试验(HZA)来与精子结合.因为要考虑卵子各个不同的结合部位, 所以在ZBA中需要大量的卵子,才能测出精子的受精能力.但有些动物不易获得大量的卵子,反而影响了最后结果的可靠性.在HZA中,卵子被分为两半,用每半来评价精子的结合能力.但对卵子进行等份分割具有一定的难度,目前已经应用于人,马和猪精子能力的分析".就实际操作而言,ZBA和HZA都比较繁琐,而且对操做者的熟练程度依赖性高.用溶解的ZP来评价精子,需要相对少的卵子,是一种非常有前景的方法.其可以克服ZP结合位点的变化所带来的结合精子数目不准确的问题.并且可以用流式细胞计数仪来进行大量精子的检测.总之,精液的质量检测在生产实践中具有重要作用,其首要目的就是要快速,准确的确定精子的受精能力.常规的检测方法可重复性差,准确性低,易受操作者的主观影响,不能准确的反应精子的功能状态.而以上所提到的检测染色质结构,顶体完整性,线粒体活性,以及获能的荧光探针染色技术具有简单,易行和可靠等特点.在精液的质量评价中具有很高的应用价值.如能结合流式细胞记数仪来分析,则能更为客观,准确的评价精子的质量,但流式细胞记数仪价格昂贵,限制了其在实际生产中的应用.准确的预测精子的受精能力,是受精成功的关键.随着动物精子体外保存技术的不断发展,体外评价精子质量的方法吐王在不断的进步.尽管人们做了许多努力来提高预测精子受精能力的准确性,但到目前为止还没有单一的方法或技术能准确的预测精子的受精能力,必须几种方法结合使用,这些方法也只应用人,家畜及试验动物,在野生动物方面还有待进一步研究.参考文献:lIjEvensonDP.Lossoflivestockbreedingefficiencyduetoutleonl—pensablespermnucleardefects[J].ReproductionFertilityandDe velopment,1999,11:1—152jKarabinusDS,V olgerCJ,SaackeRG,eta1.Chromatinstruetural changesinspermafterscrota]insulationofHolsteinbulls[J].Jour—nalofAndrolo~v,1997,18:549555.13jHammerstedtRH,GrahamJK.NolariJP.Cryopreservation0f mammaliansperm:Whatweaskthemtosurvive[J].Journal0f Andrology,1990,11:73—88l4]KrogenesA,Andersen—BergK,HafneAL.et31.Membranealter—ationsnbullspermatozoaafterfreezingandthavdngandafterin vitrofertilization[J].ActaV eterinarySeandinavia,1994,35:17.26?[5]ChengFP,GadellaBM.V oorhoutWF.eta1.Progesterone,in—ducedacrof~mereactioninstMlionspermatozoaismediatedbya plasmamembraneprogesteronereceptor[】].BiologyofReproduc. tion.1998.59:733.7426jNieGJ,WenzelJGWAdaptationofthehypoosmoticswelling testtoasses$functionalintegrityofstallionspermatozoalplasma membranes[J].Theriogenolo~v,2001.55(4):1005.1018.(下转第204页)204经济动物2004矩(TD—PCR)才能扩出目的片段来,但产量甚微,于是决定放弃此对引物,又重新设计并合成了1对新引物(RPN.,RPN).应用新引物扩增时多次扩增出1条约750bp的片段,而"目的片段不出现".针对上述问题,对4种引物进行了分析,发现PN.,PN可作为套式PCR的外引物,而PN,作为内引物,并且3个引物之间无交叉错配现象,不能形成发卡结构和引物二聚体,故此决定采用半嵌套式PCR进行扩增,研究也因此得到了意外的收获,即当产物用EB染色检测不到,而产物中又存在大量的假象带时,应用套式引物来检测目的片段是否已经被扩增出.这合理地解释了为什么第1轮仅扩增出1条约750bp的片段,在第2轮扩增时才出现目的片段.但不可否认第1轮就已经扩增出目的片段,只是产物量少,用EB检测不到(上接第201页)[7]GarnerDL,ThomasCA,JoergHW,eta1.Fluorometricassess—ment~ofmitoehondrialfunctionandviabilityincryopreservedbo? vinespermatozoa[J].BiologyofReproduction,1997,57(6):l40l—l4O6.[8]霍立军,杨增明.哺乳动物精子质量的评价方法[J].动物学杂志,2002,37(2):89—93.[9]OzakiT,TakabashiK,KanasakiH,eta1.Evaluationofacrosome reactionandviabilityofhumanspermwithtwofluorescentdyes【JJ. ArchGy'necolObstet,2002,266:114—117.【10]GrahamJK,KunzeE,HammerstedtRH.Analysisofspermcell viability,acrosomalintegrityandmitochondrialfunctionusingflowcytometry【JJ.BiologyofReproduction,1990,43:55—64. [11]SzaszF,SirivaidyapongS,ChengFP,eta1.Detectionofcalci—umionophorcinducedmembranechangesindogspermasasimple methodtopredictthecryoprcservabilityofdogsemen[J].Molecu—larReproductionDevelopment,2000,55:289—298而已.参考文献:吴乃虎.基因工和原理(第2版)[M]+北京:科学出版社, 1998:105一lo7.罗廷荣,源宣之.NestedPCR检测狂犬病病毒方法的建立及病毒在小鼠体内的移行动态[J]中国兽医,2O(}O,20 (6):535—538.聂立欣,孔小明,刘海,等.半套式PCR检测石蜡包埋组织中猪圆环病毒2型方法的探讨[J].动物医学进展,2004, 25(1):80-82.高荣琨.用套式PCR检测空气样品中猪肺疫霉形体[J].李彦明摘译.中国畜牧兽医,2004,31(6):3741.沈海娥,郭福生,张影,等.应用套式PCR法检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的试验[J].试验研究,2003:22(7):21—23.[12]SzabolcsNagy,JohannesJansen,EinkoK. flowcytometrlcmethodtoassessplasma—and[13][14][15]eta1.Ap】e—stain integrityofcryopreservedbovinespermimmediatelyafterthawing inpresenceofegg-yolkparticles[J].BiologyofReproduction, 2003,68:l828.1835.FazeliAR,SteenwegW,BeversMM,eta1.Developmentofaspermzonapellucidabindingassayforbull~men[J].TheV eteri—naryRecord,1993,132:14—16.FazeliAR,HoltC,SteenwegC,eta1.Developmentofsperm hemizonabindingassayforboarsemen[J].Theriogenology, 1995,44(1):17—27.StromHolstB,LarssonB,Linde—ForsbergC,eta1.Evaluationof chilledandfrozen-thawedcaninespermatozoausingzonapelluci—dabindingassay[J].JReproductionFertility,2000,l19(2):20j一206L=J。
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万方数据
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哺乳动物精子质量检测的原理及应用
作者：唐宜俊， 叶绍辉
作者单位：云南农业大学动物科学技术学院,昆明,650201
刊名：
上海畜牧兽医通讯
英文刊名：SHANGHAI JOURNAL OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE
年，卷(期)：2009(2)
被引用次数：2次
1.Garner DL;Johnson LA Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide[外文期刊] 1995(02)
2.Pena A;Johannisson A Post-thaw evaluation of dog spermatozoa using new triple fluorescent staining and flowcytometry[外文期刊] 1999(06)
3.徐立滨;霍立军;于浩猪精液中精子质量的检测[期刊论文]-黑龙江畜牧兽医 2005(05)
4.Nie GJ;Wenzel JG Adaptation of the hypoosmotic swelling test to assess functional integrity of stallion spermatozoal plasma membranes[外文期刊] 2001(04)
5.Kawakami E;Morita Y;Hori T Lectin2binding char acteristics and capacitation of canine epididymal spermatozoa 2002(07)
rson JL;Miller DJ Simple histochemical stain for acro-somes on sperm from several species 1999
7.Rodriguez-Martinez H;Larsson B;Zhang BR In vitro assessment of viability and fertilizing capacity of bull spermatozoa 1997(01)
8.Sirivaidyapong S;Cheng FP;Marks A Effect of sperm diluents on the acrosome reaction in canine sperm[外文期刊] 2000(03)
9.Hammerstedt RH;Graham JK;Nolan JP Cryopreservation of mammalian sperm:What we ask them to survive 1990
10.Thomas CA;Garner DL;DeJarnette JM Fluorometric assessments of acrosomal integrity and viability
in cryopreserved bovine spermatozoa[外文期刊] 1997(04)
11.Krogenes A;Andersen-Berg K;Hafne AL Membrane alter-ations in bull spermatozoa after freezing and thawing and after invitro fertilization 1994
12.Kotwicka M;Warchol JB Exp ression of progesterone membrane receptor in spermatozoa from normozoospermic and oligozoospermic men[外文期刊] 2001(02)
13.Auger J;Leonce S;Jouannet P F1ow cytometric sorting of living,highly motile human spermatozoa based on evaluation of their mitochondrial activity 1993(08)
14.Huang Y;Pan TM Relationship between sperm quality and chromatin condensation measured by sperm DNA fluorescence using flowcytometry 1998(04)
15.Strom HB;Larsson B;Linde-Forsberg C Evaluation of chilled and frozen-thawed canine spermatozoa using a zona pellucid a binding assay 2000(02)
1.田恒玖.刘志平.白玉妍常用哺乳动物精子质量检测方法[期刊论文]-经济动物学报2004,8(4)
2.白修云.王有柱.李向臣.关伟军.BAI Xiu-yun.WANG You-zhu.LI Xiang-chen.GUAN Wei-jun哺乳动物精子质量
检测原理及方法[期刊论文]-中国畜牧兽医2007,34(9)
3.曾金雄.戴西湖.刘建华.杨家辉.陈锦风.林木南首乌还精胶囊体外对人精子运动能力和受精能力的影响[期刊论文]-中华男科学2003,9(6)
4.霍立军.杨增明哺乳动物精子质量的评价方法[期刊论文]-动物学杂志2002,37(2)
5.袁玉英.何春娜.石其贤.YUAN Yu-ying.HE CHUN-NA.SHI Qi-Xianγ-氨基丁酸诱发人精子顶体反应及其受精能力[期刊论文]-生理学报1998,50(3)
6.陈秋菊.朱伟杰.李菁.CHEN Qiu-ju.ZHU Wei-jie.LI Jing衰老对小鼠精子成熟和受精能力的影响[期刊论文]-中国病理生理杂志2005,21(4)
7.韩海棠.李赞东.Han Haitang.Li Zandong PMSG对鸡卵子受精及发育能力的影响[期刊论文]-塔里木大学学报2008,20(3)
8.安刚.黄天华.谢庆东.王德刚.AN Gang.HUANG Tian-hua.XIE Qing-dong.WANG De-gang pCXN2-mIZUMO对
C57BL/6小鼠生育能力的影响[期刊论文]-癌变·畸变·突变2007,19(4)
9.周晨曦.王晓飞.陈小章.ZHOU Chen-Xi.WANG Xiao-fei.CHAN Hsiao-Chang雌性生殖道碳酸氢根分泌机制及其对精子受精能力的影响[期刊论文]-生理学报2005,57(2)
10.冯俭磷酸二酯酶-5抑制剂对精子参数和受精能力的影响[期刊论文]-中国男科学杂志2008,22(8)
1.赵冰.徐振军.杨高娃.白桂芬.刘冰头孢曲松钠对雄性小鼠生殖细胞的影响[期刊论文]-赤峰学院学报（自然科学版） 2011(2)
2.赵冰.徐振军.李建娇.白桂芬.刘冰克林霉素对雄性小鼠精子功能的影响[期刊论文]-安徽农业科学 2010(36)
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