第十二章 植物种质资源离体保存 (2)

第十二章植物种质资源离体保存

1植物种质资源离体保存的概念和意义

保持生物多样性(biodiversity)是一个国际性备受重视的问题。由于生态平衡的破坏，大量物种正在逐渐丧失或毁灭。人工选择及良种的推广，品种构成逐渐单一化，致使许多潜在有益的珍贵种质资源被丢失，而种质资源是植物育种工作的基础，因此，搜集和保存种质资源已受到世界各国的重视。

植物种质资源保存的方式有原生境保存(in situ conservation)和非原生境保存(ex situ conservation)，后者包括移地保存(种质圃或植物园保存)、种质库(种子)保存、离体(试管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明显的重要性，但要保存大量种质，则需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际上很难实施，而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物种质资源的丧失。这两种方式保存的种质也不利于种质资源的交流。而种子保存又存在以下限制因素：①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；②无性繁殖的植物(如香蕉)难于采用种子保存；③采用无性繁殖来保持其优良性状的植物(如许多果树)，用种子繁殖后代会发生变异；④顽拗型种子（根据干燥对种子生命力的影响可将热带种子分为两大类：即顽拗型种子与正统型种子。顽拗型种子不能进行干燥处理，在日常温、湿度条件下干燥也会很快丧失生命力，其种子的含水量通常不能降低到 12％以下，否则种子将死亡。这类种子也不能在低温下贮藏。生长在热带的藤黄科、山榄科、龙脑

香科、番荔枝科、无患子科、马钱科等植物都是这类种子）植物不宜用种子保存或保存难度很大；⑤易遭自然灾害袭击而丢失。

基于上述原因，从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源的离体保存(germplasm conservation in vitro)是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。在超低温保存中，也经常直接采用植物茎尖或分生组织、胚、花粉等材料作为保存材料。离体种质保存有以下优点：①所占空间少，节省大量的人力、物力和土地；②便于种质资源的交流利用；③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；④避免自然灾害引起的种质丢失。当然，离体种质保存也有一些值得注意的不足之处：①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；②易受微生物污染或发生人为差错；③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失。70年代以来，人们把冷冻生物学(cryobiology)和植物离体微繁结合起来，发展了离体种质资源冷冻保存(freezing conservation in vitro)或超低温保存(cryopreservation)的技术。随着离体种质保存技术的不断发展和完善，已经或正在建立离体种质保存库。

2植物种质资源离体保存的方法

2.1限制生长保存

限制生长保存利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方

法，是离体种质保存的一种常用策略。限制离体培养物生长速度的方法很多，如低温、提高渗透压、加生长延缓剂(或抑制剂)、干燥、降低氧分压、矿物油覆盖等。这些方法的基本原理类似，即严格控制某种或某几种培养条件，限制培养物(保存材料)的生长，只允许其以极慢的速度生长。这样，转移继代的间隔时间可延长。但应用这些方法时必须注意：①为了降低培养基水分的蒸发速度，要注意贮存容器的类型和密闭方式。②有较大的变异可能性，必须定期对保存材料进行细胞学、遗传学和生产性状的鉴定。

2.1.1低温保存法

低温保存(low temperature conservation)是限制生长应用最广的方法。一般是在l～9℃(一些热带、亚热带植物在10～20℃)下培养，并经常同时提高培养基的渗透压。在这种条件下，培养物的生长受到限制，继代培养时间间隔数个月至1年以上。这对中、短期种质的贮存是非常合适的。一旦要利用这些种质，只要把培养物转移到常温(正常)下培养，即可迅速恢复生长。

2.1.2高渗透压保存法

高渗透压保存法就是通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长速度的保存方法。这种方法主要是通过影响离体培养物的吸收作用而减缓培养物的生长。一般来说，离体培养物正常生长所使用的培养基蔗糖浓度为2％～4％，提高蔗糖浓度到10％左右，就可达到抑制培养物生长的目的。

提高培养基的渗透压还可采用外加甘露醇、山梨醇等惰性物质

(不易被培养物吸收)来提高渗透压，这样可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久。一般可用2％～3％蔗糖加2％～5％的甘露醇处理。如在马铃薯外植体的培养基上加入8％蔗糖或3％甘露醇，均可降低培养物生长速度，延长继代培养间隔期。但要注意渗透压太高可能导致培养物死亡。此外，还可以通过增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压。

2.1.3生长抑制剂(或延缓剂)保存法

常规组织培养的培养基中，通常是附加生长素或细胞分裂素，以促进外植体生长与发育。但在离体种质资源保存中，则通常采用添加外源生长抑制剂(或延缓剂)来延缓培养物的生长。最常用的是天然生长抑制剂—ABA，具有抗赤霉素的作用，阻碍RNA聚合酶的活性，抑制DNA合成，从而达到抑制外植体生长的目的。此外，常用的还有青鲜素、矮壮素、二甲氨基琥珀酸酰胺(B9)、多效唑等人工合成的植物生长抑制剂。

2.1.4降低氧分压保存法

通过降低培养容器内的氧分压，改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的，其原理类似于果蔬类的贮藏保鲜方法。如果培养容器内的氧分压太低，则会产生毒害作用。

2.1.5干燥保存法

水是生命活动的基质，降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥贮存类似。如对胡萝卜体细胞胚、愈伤组织进行

脱水处理(将离体材料放在滤纸上，置于空气流动的无菌箱中风干4～7d)，然后置于加生长延缓剂或限制蔗糖的条件下保存。在不含蔗糖而其他条件正常的培养基上可以保存2年。

利用限制生长方法进行植物无性系的离体保存，简便易行，材料恢复生长快，适于现代化种质库的管理。值得一提的是，离体保存植物种质时，不同植物、不同基因型或同一品种的不同材料，所采用的保存方法也大不相同。具体采用哪种保存方法，可能与品种的特性和基因型有关。在离体种质保存的实际操作中，通常是把两种或两种以上的保存方法结合使用，更有助于延长不同植物的保存年限。

2.2超低温保存

2.2.1植物超低温种质保存的概念

20世纪70年代，Nay和Street首先证明植物悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长，从而导致了种质资源超低温保存法的发展。植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温(一196℃液氮)条件下进行保存的方法。目前，采用超低温保存植物离体种质获得成功的有草莓茎尖、苹果冬眠芽、香蕉茎尖、猕猴桃茎尖、薯蓣茎尖、马铃薯茎尖、苹果根尖、甘薯茎尖等。

2.2.2超低温保存的基本原理

将要保存的离体种质经过一定方法进行处理，然后将其保存在液氮中(－196℃)。在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了，

因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。

低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就会遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分裂和分化，就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的。但是，植物细胞含水量比动物细胞高，在冷冻(freezing)过程中，会有冰晶形成和过度脱水，在解冻(thawing)过程中也会重新形成冰晶和遭受温度冲击(thermal shock)，保存难度大。如果直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。因此，植物种质超低温保存必须采取如下措施：①选择细胞内自由水少、抗冻能力强的植物材料；②采取一些预处理措施，提高植物材料的抗冻能力；③在冷冻过程中尽量减少冰晶的形成，避免组织细胞过度脱水；④在解冻过程中避免冰晶的重新形成以及温度冲击导致的渗透冲击(osmotic stress)等。

2.2.3超低温保存的基本程序

超低温保存有一套比较复杂的技术程序，基本程序包括：植物材料(培养物)的选取、材料的预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻、再培养等(图12－1)。如果操作不当，保存就会失败，因此，必须掌握好整个技术程序的各个环节。

图12－1 植物离体材料超低温保存的基本程序

2.2.

3.1植物材料(培养物)选取

已经研究或应用过的植物材料或培养物主要有三类：①愈伤组织、悬浮细胞、原生质体；②花粉和花粉胚；③茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株。

超低温保存离体种质的实际应用中，需综合考虑培养物的再生能力、变异性(材料本身)和抗冻性。选择遗传稳定性好、容易再生和抗冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关键。在早期的离体种质保存研究中，主要用悬浮细胞和愈伤组织为保存材料，建立离体超低温保存的基本技术程序。实际上悬浮细胞和愈伤组织并不是理想的离体种质保存材料，因为它们存在着非常普遍的遗传不稳定现象，在现有的技术条件下，尚无有效的控制措施，并且

有些植物的悬浮细胞和愈伤组织经过长期保存，再生能力较差。而采

用茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株等有组织结构的离体材料，由于其遗传稳定性好，易于再生，且细胞体积小、液泡小，含水量较低，细胞质较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻，因此是理想的离体保存材料。

此外，选择合适生理状态和树龄的材料作为培养物，也是超低温保存应考虑的重要因素。一般来说，小而细胞质浓厚的分生细胞比大而高度液泡化的细胞容易存活。在较大的材料如茎尖、胚或试管苗中，由于高度液泡化的细胞受到严重损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。幼小的球形胚比老龄胚存活率高。

2.2.

3.2材料预处理

预处理的目的是使材料适应将遇到的低温条件，提高新分裂细胞的比例。因为新分裂细胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易有大冰晶形成，细胞不易受害。

在实际操作中，往往采取一些措施来提高材料的抗寒能力，从而提高冷冻后材料的存活率和再生能力。常采用的办法是对超低温保存的离体培养物进行低温预处理和加入冷冻防护剂。低温预处理是将离体培养物置于一定的低温环境中，使其接受低温锻炼，提高其抗寒能力。冷冻前或冷冻期间，由于细胞脱水，导致细胞内可溶物的浓度在原生质体中增加，冷冻防护剂可以防止这种毒性的溶解效应。目前常用的冷冻防护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、脯氨酸、糖类、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。对植物来说，DMSO是最好的防护剂，用于培养细胞的适宜浓度是5％～8％。

要提高新分裂细胞的比例，可选取具有良好生理状态和合适年龄的植物材料，将其进行预培养，即在合适的固体或液体培养基上培养一段时间，使其细胞达到旺盛的分裂生长状态。对悬浮细胞和愈伤组织来说，加速继代可提高小细胞的频率。这有助于冷冻处理后的存活。

此外，将细胞脱水到适当程度，也能显著提高植物材料在冷冻和解冻后的存活率。

冷冻前材料预处理的具体方法是：先选取具有良好生理状态和合适年龄的植物材料，将其进行预培养，即在合适的固体或液体培养基上培养一段时间，使其细胞达到旺盛的分裂生长状态。对悬浮细胞和愈伤组织来说，加速继代可提高小细胞的频率。然后，把茎尖或细胞等培养物放在提高蔗糖浓度、添加二甲基亚砜和(或)脯氨酸、温度接近0℃的条件下培养数日。

2.2.

3.3冷冻处理

常采用四种冷冻方法，即慢冻法(slow cooling method)、快冻法(fast cooling method)、预冻法(pre-freezing method)和干冻法(dry-freezing method)。

(1) 慢冻法慢冻法应用较为普遍，其特点是投入液氮前先有一个低温的过程。慢冻法是分步进行的，其基本操作为：先以1～5℃／min的速度降温，降至-30～-40℃或-100℃,平衡1h左右，此时细胞内的水分减少到最低限度，再将样品放人液氮中(至-196℃)保存。

慢冻法可以使细胞内的自由水充分扩散到外面，避免在细胞内部形成冰晶，即使是体积较大、含水量较高的植物材料，也可以得到较

好的保存效果。此法适合于大多数植物离体种质的保存，对茎尖和悬浮培养物尤其适用，但要求严格控制降温速度。

(2)快冻法快冻法是对预处理过的材料以100～1 000℃／min 的速度降温，直至-196℃冷冻保存。这种冷冻方法比每分钟降几十度的速度要好，普遍认为冰晶增大的临界温度很快过去，结果细胞内形成的冰晶体没达到使细胞致死的程度。

一般认为，植物的花粉、种子等高度脱水的材料以及经低温锻炼的木本植物的枝条和芽，均可用快冻法保存。采用此法已成功保存了一些植物的离体种质，如草莓、马铃薯、奢蓣、苹果根尖等。

(3)预冻法预冻法是将植物组织放人液氮前，先经几个阶段的预冻，如-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃，然后再转入-196℃液氮中。此法已较少使用。

(4)干冻法干冻法是把样品放人烘箱内或真空中，使其脱水(dehydration)，提高其抗冻性，然后再放人液氮中保存的方法。不容易产生脱水损伤的植物材料，采用此法有利于提高冷冻保存后的存活率。

2.2.

3.4冷冻贮存

在冷冻贮存期间，由于液氮在不断挥发，所以，必须定时补充液氮以保证植物材料的持续保存。如果冷冻在-196℃下的材料要长期贮存，则需一个液氮冰箱。一个冰箱大约保存4 000个容量为2ml的瓶，每周消耗20～25L液氮。迄今为止，仍发现液氮贮存不是无期限的，随着贮存时间的延长，细胞活力会有一定的下降。因此，这项技术仍

需改进。

2.2.

3.5解冻

解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。解冻的速度是解冻技术的关键，解冻可分为快速解冻(fast thawing)和慢速解冻(slow thawing)两种方法。解冻的速度慢，细胞内容易发生再结晶，导致细胞死亡；速度快，再结晶的过程来不及发生，细胞存活率高。

（1）快速解冻法快速解冻法就是把冷冻的材料取出后，迅速放入35～40℃(该温度下解冻速度一般为500～700℃／min)温水浴中解冻，并小心摇动(因为冷冻后的组织脆弱易受损伤)，待材料中的冰晶完全融化为止。由于此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻，为多数研究者采用。

（2）慢速解冻法慢速解冻法是把材料置于0℃或2～3℃的低温下慢慢融化。少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活，如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷冻的过程中，经受了一个低温锻炼过程，细胞内的水分已最大限度地渗透到细胞外，若解冻速度太快，细胞吸水过猛，细胞膜就会受到强烈的渗透冲击而破裂，进而导致材料死亡。因此，解冻速度的选择应参考冷冻速度。

2.2.

3.5再培养

由于冷冻防护剂对植物细胞可能有毒害作用，因此在解冻后培养之前，一般要把已解冻的材料用培养基清洗若干次，以除掉冷冻防护

剂，然后再接种到新鲜培养基上进行再培养，但有的材料洗涤后反而培养不活，应直接接种于新鲜培养基上。如玉米冷冻细胞不宜洗涤立即进行培养，应将融解后的样品直接置于琼脂培养基上培养，l～2周后培养物即可正常生长。这可能是由于当进行彻底冲洗的时候，细胞在冷冻过程中渗漏出来的某些重要物质被洗掉了的缘故。

当重新培养曾在-196℃下冷冻过的材料时，为了提高存活率，可能需要某些特殊的条件。例如，只有当培养基中补加了GA3以后，冷冻过的番茄幼苗的茎尖才能直接发育成小植株。若不加GA3，茎尖则形成愈伤组织，然后分化出不定芽。但对照(未经冷冻过的)茎尖不需要GA3就能直接长成小植株。此外，加入活性炭可以显著提高经过冷冻和解冻的胡萝卜试管苗的总的存活率。

有一部分材料在冷冻保存时被冻死，使得再培养的成活率达不到100％，因而需要测定培养物活力，以剔除没有生活力的培养物。测定方法有FDA（荧光素双醋酸酯）染色法、TTC（氯化三苯基四氮唑）还原法、Evans Blue染色法等。多数情况下，存活率在20％～80％之间。

不同植物材料以及不同保存程序的超低温保存效果不同。如低温(2℃)锻炼过的金冠和富士苹果的茎尖，超低温保存后成活率可达80％；薯蓣的两个种Dioscorea alata和D．bulbifera．经超低温保存后，其茎尖分别有60％和20％成活率，并再生完整植株。超低温保存方法已在香蕉、甘薯、芋头、马铃薯、木薯等重要经济植物上建立了较为成熟的技术程序，并用于实际的大规模离体种质保存。

复习思考题：

1、植物种质资源离体保存的概念是什么？它有哪些优缺点？

2、限制生长保存的方法有哪些？

3、植物超低温保存的概念是什么？它的基本操作程序如何？