检测猪圆环病毒2型SYBRGreen_荧光定量PCR方法的建立_张锦秀
《猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准编
《猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准编《猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法》河南省地方标准编制说明猪圆环病毒病是由2-型圆环病毒（（Porcine circovirus type2，PCV2）为主要病原、单独或继发或混合感染其他致病微生物的一系列疾病的总称。
猪感染PCV2后，临床症状多种多样，主要主要表现为体质下降、进行性消瘦、生长发育不良、呼吸困难、贫血、黄疸、腹泻、母猪繁殖障碍、内脏器官及皮肤的广泛病理变化，特别是肾、脾脏及全身淋巴结的高度肿大、出血和坏死。
如果与其他病毒协同感染，猪的发病率和死亡率将大大提高。
猪圆环病毒病每年给养猪业造成巨大的经济损失，尤其是近年来对养猪业危害日趋严重。
临床上猪圆环病毒病还常与其他病原如猪繁殖与呼吸道综合症病毒、猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪流感病毒、多少性巴氏杆菌及猪肺炎支原体等混合感染，造成患病猪死亡率增加。
更重要的是，混合感染的病原引起的临床症状非常相似，单凭临床症状往往无法确诊，这就增加了养猪业的经济损失，因此必须借助实验室诊断用于确诊。
此外，许多猪群感染猪圆环病毒后并不表现出明显的临床症状而处于潜伏感染状态，一旦外界环境改变、机体患有其他疾病或者抵抗力降低时，即可引发该病；因此建立猪圆环病毒II型的检测方法对于该病的早期诊断、检测、防治及猪群的净化显得尤为重要。
但迄今尚未有较好的猪圆环病毒病病原学诊断方法。
目前对PCV2的实验室诊断方法主要是免疫组化法、传统PCR法和血清学诊断法。
采用免疫组化法费时费力，需要几天甚至几周的时间。
因此难以推广应用；因为病原学实验室中往往存在DNA污染以及在样品采集过程中也常发生交叉污染，所以采用传统的PCR法也存在一定的漏检与误诊；血清学诊断方法主要是利用ELISA试验检测血清抗体，但该方法不能说明机体的带毒状况，而且易出现非特异性结果。
因此，目前急需要建立一种迅速、准确、易于操作、适于推广的PCV2检测方法。
猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其在临床检测中的应用
猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其在临床检测中的应用刘健;曹火仁;周锦萍;鞠厚斌;张维谊;王建;刘佩红【摘要】选择猪圆环病毒2型(PCV-2)基因保守区设计1对引物P1和P2,扩增536 bp的片段,该方法可以特异地检测出PCV-2的DNA,而对猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒及未接PCV-2的PK-15细胞均呈阴性;该法能检测出29 ng/L 的病毒DNA.对扩增片段进行测序,结果表明扩增片段属于PCV-2.应用该方法对2008年度上海及周边地区送检的91份临床样本进行了PCV-2的检测,结果表明,阳性样本为52份,阳性率为57.14%.研究结果表明,建立的PCR方法检测PCV-2具有较好的敏感性和特异性,可用于PCV-2感染疑似病例的诊断及其分子流行病学调查.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)007【总页数】3页(P64-66)【关键词】PCV-2;PCR;检测【作者】刘健;曹火仁;周锦萍;鞠厚斌;张维谊;王建;刘佩红【作者单位】上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103;上海市松江区动物疫病预防控制中心,上海,201611;上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103;上海市动物疫病预防控制中心,上海,201103【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属,为无囊膜,单股、环状、闭合的 DNA 病毒,病毒粒子直径为17～20 nm,是已知最小的动物病毒(马其国等,2008)。
1982年Tischer等首先发现猪圆环病毒(PCV),但其致病性直到1991年才被Clark报道,该年在加拿大的猪群中存在一种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的新病,给养猪业造成了巨大的经济损失;之后美国、法国等纷纷报道了该病的发生。
猪圆环病毒PCR检测方法的建立
染。传代和接毒时细胞培养瓶的瓶塞都要换新的。
1.4.4 病毒 DNA 的提取
1.4.4.1 - 20℃冻存的 PCV- 2 毒室温下用电风扇吹融化后
备用。
1.4.4.2 取 320μL 毒液加 40μL TNE 缓冲液和蛋白酶 K
和 SDS，其中蛋白酶 K 和 SDS 的终浓度为 100μg/mL 1%。
1min30s，72℃ 1min30s，进行 30 个循环后，72℃延伸 10min。
30 2010 年第 10 期
1.4.5.3 PCR 完成后，取出放入 4℃冰箱准备电泳。 1.4.6 电 泳
⑴制胶：将 1.2%的琼脂糖凝胶置于电炉上加热融化后， 倒入胶板内，加上梳子，待冷却后，取出梳子，出现几个小坑 槽，以备跑胶时点样用。用镊子轻轻取出琼脂糖放入电泳槽 内，加入电泳液液面超过胶面即可。⑵点样：加样时用加样枪 吸取 7μL PCR 液混入一点点 Loadingbuffer 染色液呈现微蓝 色，慢慢吹入胶孔内。第 1 个孔内加 DNA Marker, 不染色，第 2 个和第 3 个孔依次放入 PCR 液，接通电源 U=133V, 一般 15min 即可，不要时间过长，以免跑出琼脂糖后不好观察。⑶用 紫外分析仪先初步观察结果，然后放入凝胶成像仪中扫描存 盘。注意：电泳液中含有致癌物质，所以整个过程中，始终要戴 PE 手套，注意自我保护，在操作紫外分析仪和凝胶成像仪的 时候要摘掉手套，以免将有毒物质传播给其他人。 2 结果与分析
变，所以很难了解病毒的生长情况，但是也要设立对照组，检
测病毒的生长情况用间接免疫荧光法。始终注意：在进入无
菌操作台前先用酒精棉擦净手，操作过程中始终保持无菌操
作，使用前打开紫外灯至少照射 10min 杀菌。使用后，收拾好
猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR_GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：猪圆环病毒（PCV ）包括猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）。
近些年来，PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染，因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 鉴别检测方法显得尤为必要。
本试验通过特异性引物筛选，各项反应条件优化，建立了实时荧光定量PCR 鉴别方法。
结果表明：PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL 。
与猪瘟病毒（CSFV ）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）、猪伪狂犬病病毒（PRV ）、猪细小病毒（PPV ）均无交叉反应。
批内及批间变异系数均小于1%。
对98份PCV 疑似阳性病料检测结果表明，PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%，共感染率为7.1%。
该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。
关键词：猪圆环病毒；特异性；敏感性；SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0085-07D evelopment and Application of a SYBR Green Real-Time Quantitative PCR Method for Differentiation of Porcine Circoviruses 1, 2 and 3收稿日期：2021-05-24基金项目：山东省重大科技创新工程项目（2023CXGC010705）；山东省现代农业产业技术体系项目（SDAIT-08-06）；山东省自然基金（ZR2022MC011）；济南市“新高校20条”资助项目（202228112）；山东省科技型中小企业创新能力提升工程（2023TSGC0734）；山东省农业科学院创新工程（CXGC2018E10, CXGC2023G03, CXGC2023E02, CXGC2023A21）作者简介：田瑶，女，硕士，主要从事动物病毒学与免疫学研究通信作者：李俊，E-mail：***************；韩先杰，E-mail：**********************猪圆环病毒1型、2型、3型 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 鉴别方法的建立及应用田 瑶1,2，时建立2，彭 喆2，李 琛2，徐绍建2，吴晓燕2,3，李佳昕1,2，杨 莹2,3，王 硕2，刘 畅2，韩 红2，李 俊1,2,3，韩先杰1（1.青岛农业大学动物医学院，青岛266109；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南250100；3.山东师范大学生命科学院，济南250100）2023,31(6):85-93Abstract: Porcine circovirus (PCV) includes three genotypes: Porcine circovirus 1 (PCV1), Porcine circovirus 2 (PCV2) and Porcine circovirus 3 (PCV3). In recent years, there have been co-infections among these 3 genotypes. Therefore, it is particularly necessary to develop a fast, specifi c and sensitive SYBR Green I real-time quantitative PCR method for differentiation of PCV1, PCV2 and PCV3. In this experiment, a real-time fl uorescent quantitative PCR method was developed by using specifi c primers and optimizing various reaction conditions. The results showed that the lower limits of detection were 40.3 copies/μL for PCV1, 25.2 copies/μL for PCV2 andTIAN Yao 1,2, SHI Jianli 2, PENG Zhe 2, LI Chen 2, XU Shaojian 2, WU Xiaoyan 2,3, LI Jiaxin 1,2,YANG Ying 2,3, WANG Shuo 2, LIU Chang 2, HAN Hong 2, LI Jun 1,2,3, HAN Xianjie 1(1. College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine , Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 3. College of Life Sciences, Shandong Normal University,Jinan 250100, China)· 86 ·中国动物传染病学报2023年12月猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是圆环病毒科圆环病毒属的一种无囊膜环状单链 DNA 病毒，也是迄今为止发现的具有自主复制能力的最小的动物病毒[1-2]。
猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法[发明专利]
![猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ae541406aeaad1f347933f6a.png)
专利名称：猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法
专利类型：发明专利
发明人：孙世琪,张韵,郭慧琛,智晓莹,魏衍全,常艳燕,郜原
申请号：CN201610190933.0
申请日：20160330
公开号：CN105785037A
公开日：
20160720
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种猪圆环病毒优势抗原表位肽建立快速检测层析试纸条及制备方法，可用于快速检测猪血液或血清中的抗体。
试纸条包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。
金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的重组G蛋白，检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG。
本发明的试纸条操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、工艺简单可大量制备，成本低廉，适合基层大批量现场检测并可用于猪群PCV2感染的早期快速诊断。
申请人：中国农业科学院兰州兽医研究所
地址：730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪1号
国籍：CN
代理机构：北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：黄浩威
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猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用
猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用曹胜波;陈焕春;肖少波;何启盖;徐引弟;刘军发【期刊名称】《华中农业大学学报》【年(卷),期】2001(20)1【摘要】根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。
将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。
将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。
用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料。
【总页数】4页(P53-56)【关键词】猪环状病毒2型;检测方法;聚合酶链反应【作者】曹胜波;陈焕春;肖少波;何启盖;徐引弟;刘军发【作者单位】华中农业大学畜牧兽医学院【正文语种】中文【中图分类】S858.284.43;S852.659.【相关文献】1.猪流行性腹泻病毒、猪肠道病毒9型及猪嵴病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用 [J], 任玉鹏;张斌;岳华;刘燕2.多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立 [J], 岳丰雄;崔尚金;冉多良;戚亭;周盛华3.猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用[J], 于新友;李天芝;沈志强;王金良;莫玲4.猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用[J], 于新友;李天芝;沈志强;王金良;莫玲;5.同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细环病病毒1型和2型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立[J], Pérez L J;刘丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪圆环病毒2型Taqman荧光定量PCR检测方法的建立及应用
猪圆环病毒2型Taqman荧光定量PCR检测方法的建立及应用郑敏;黄梅清;吴南洋;陈少莺【摘要】参照GenBank收录的PCV2ORF2基因设计合成引物和Taqman探针,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,对临床确诊PCV2的病料和30份临床疑似感染PCV2的病料进行检测,同时与常规PCR检测方法进行比较.结果显示,TaqMan荧光定量PCR检测方法灵敏度可达4.5×103拷贝·μL-1,比普通PCR 检测方法高10倍；对30份疑似感染PCV2病料的检测表明,TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为66.7％和56.7％,两者符合率90％.应用TaqMan荧光定量PCR检测方法检测PRV、CSFV、PRRSV结果均为阴性,无交叉反应；表明该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,可用于PCV2的流行病学调查和临床诊断.%The probes and primers were designed according to the nucleotide sequence of porcine circovirus type 2 (PCV2) available in GenBank, and real-time TaqMan fluorescence quantitative PCR for detection of PCV2 was established successfully. Clinical diagnosis of PCV2 samples and the 30 suspected samples were detected by using the established quantitative PCR which was compared with that of routine PCR. The results indicated that the established quantitative PCR assay could detect 4. 5 × 103 copys · μL-1 of plasmid DNA. Sensitivity and positive rate for clinical samples of TaqMan fluorescent quantitative PCR were higher than routine PCR* and its sensitivity was 10 times higher than that of the routine PCR. The 30 suspected samples were detected by TaqMan fluorescence quantitative PCR and routine PCR, respectively, the positivedetection rate were 66. 7% and 56.7%, the coincidence rate was 90%. Classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and pseudorabies virus (PRV) were detected by using the established quantitative PCR and the result indicated that CSFV, PRRS and PRV were negative, and had no cross reaction. The real-time TaqMan fluorescence quantitative PCR assay which is specific, sensitive and accurate can be used for the clinical diagnosis and epidemiological investigation of PCV2.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】6页(P941-946)【关键词】猪圆环病毒2型(PCV2);水解探针;荧光定量PCR【作者】郑敏;黄梅清;吴南洋;陈少莺【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013 ;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013 ;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013 ;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013 ;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州 350013【正文语种】中文【中图分类】Q786猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为无囊膜单股环状20面体对称的DNA 病毒，属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子直径17～20nm，是目前已知的最小动物病毒之一。
猪细环病毒k2型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立
ＤＥ ＶＥＬ ＯＰ ＭＥ ＮＴ ＯＦ Ａ Ｓ ＹＢ Ｒ ＧＲＥ Ｅ Ｎ Ｉ ＱＵＡＮＴ Ｉ Ｔ ＡＴ Ｉ ＶＥ ＲＥ ＡＬ － Ｔ Ｉ ＭＥ Ｐ ＣＲ ＭＥＴ ＨＯＤ Ｆ ＯＲ Ｐ ＯＲＣＩ ＮＥ Ｔ ＯＲＱＵＥ Ｔ Ｅ ＮＯ Ｓ ＵＳ ＶＩ ＲＵＳ Ｋ２
摘 要 ：为建立检 测猪细环病毒ｋ ２ 型 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｔ ｏ ｒ ｕ ｓ ｋ ２ ，Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ Ｖｋ ２）Ｓ Ｙ Ｂ Ｒ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ实时荧光定量Ｐ Ｃ Ｒ 方法 ，本
研 究根 据Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ Ｖ ｋ ２ Ｏ Ｒ Ｆ ２ 基 因序列特征设计 引物 ，建立基 于Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ 检测Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ ｖｋ ２ 的 实时荧光 定量Ｐ Ｃ Ｒ 方法 ，该方法在
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｅ ｔ ：Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｌ ｙ ａ ｎ ｄ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｔ ｏ ｒ ｑ ｕ ｅ ｔ ｅ ｎ ｏ Ｓ Ｕ Ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｋ ２（ Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ Ｖ ｋ ２ ） ． ａ Ｓ ＹＢ Ｒ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ Ｉ— ｂ ａ ｓ ｅ ｄ
细 小病毒 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｐ ａ ｒ ｖ ｏ ｖ ｉ ｕｓ ｒ ，Ｐ Ｐ Ｖ）、猪博卡病毒５ 型 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｂ ｏ ｖ ａ ｖ ｉ ｕｓ ｒ ｔ ｙ ｐ ｅ ５ ，Ｐ ｂ ｏ Ｖ５）、猪细环病毒 １ ａ 型（ Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ Ｖ ｌ ａ ）和
１ ｂ 型 （ Ｐ Ｔ Ｔ Ｓ ｕ Ｖ ｌ ｂ）核 酸 均 无 阳性 信 号 扩 增 ， 可重 复 性 好 ，组 内变异 系数 为０ ． ３ ９ ％ ～１ ． ６ ９ ％ ，组 间 变异 系数 ０ ． ６ ９ ％ 一２ ． １ ９ ％。本 方
《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》
《利用荧光定量PCR检测PCV2的方法建立及应用》一、引言猪圆环病毒2型（PCV2）是一种常见的猪病病原体，能够引起猪只发生一系列的疾病症状，给养殖业带来严重的经济损失。
为了更准确地检测PCV2，本研究利用荧光定量PCR技术建立了一种新的检测方法，并通过实验验证了其可靠性和实用性。
二、材料与方法1. 材料实验所用样本为疑似感染PCV2的猪只血清样本。
荧光定量PCR试剂盒、引物和探针等均为市售产品。
2. 方法（1）DNA提取：将血清样本中的DNA提取出来，作为PCR反应的模板。
（2）引物和探针设计：根据PCV2基因序列设计特异性引物和荧光探针。
（3）荧光定量PCR反应：将提取的DNA与引物、探针等反应体系混合，进行PCR扩增反应，并实时监测荧光信号。
（4）结果分析：根据荧光信号的强度和变化情况，判断样本中PCV2的含量。
三、实验结果1. 特异性检测利用建立的荧光定量PCR方法对PCV2和其他常见病毒进行特异性检测，结果显示该方法对PCV2具有较高的特异性，对其他病毒的交叉反应较低。
2. 灵敏度检测通过逐步稀释PCV2阳性样本，检测荧光定量PCR方法的灵敏度。
结果显示，该方法能够检测到较低浓度的PCV2，具有较高的灵敏度。
3. 实际应用将建立的荧光定量PCR方法应用于实际检测中，对疑似感染PCV2的猪只血清样本进行检测。
结果显示，该方法能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了可靠的依据。
四、讨论本研究利用荧光定量PCR技术建立了检测PCV2的方法，具有较高的特异性和灵敏度。
与传统的PCR方法相比，荧光定量PCR能够实时监测反应过程，提高检测的准确性和可靠性。
此外，该方法还能够快速、简便地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。
在实际应用中，该方法有望为猪病防控和疫情监测提供有力的支持。
五、结论本研究建立了利用荧光定量PCR检测PCV2的方法，并经过实验验证了其可靠性和实用性。
该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测出PCV2，为猪病诊断提供了新的手段。
SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立
基 金 项 目： 东 省 自然 科 学 基 金 资 助 项 目（ Ｒ２ １ＣＱ ｏ ） 山 Ｚ ０ ０ ｏ ３ ；山 东 省 农业 科 学 院高 技 术 自主创 新 基 金 资 助 项 目（０ ７ Ｘ １－４ ２ ０ ＹＣ ０ ７０ ） 作 者 简介 ： 俊 （ ９ ９） 男 ， 理研 究 员 ， 士 生 ， 要 从 事 病 毒 李 １ ７一 ， 助 博 主
方法 。
１ ３ 引 物 设 计 根 据 Ｇ ｎ ａ ｋ已 发 表 的 Ｐ Ｖ２分 ． ｅＢ ｎ Ｃ
离株 的序 列 ， 用 Ｐ ｉ ｒ． 采 ｒ ｍｅ５ ０软件 ， 设计 如 下两 对特 异性 引物 ， 扩增 猪 圆环 病毒 ２型 完 整 ＯＲ ３基 因 和 Ｆ ＯＲ ３ 因 中 １ ６ ｐ片 段 ， 物 由上海 生 工 生物 工 Ｆ 基 ９ｂ 引
程 技术服 务有 限公 司合成 。
表 １ Ｓ ＹＢＲ Ｇｒｅ ｅｎ Ｉ荧 光 定 量 Ｐ ＣＲ检 测 猪 圆 环 病 毒 引 物 序 列
பைடு நூலகம்
注 ： 、 用 于扩 增 完 整 ＯＲ ３阅读 框 ； Ｏ１ ０２ Ｆ ＹＧ１、 ２用 于 扩 增 Ｏ ３中 特异 片段 ＹＧ ＲＦ
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中 图分 类 号 ：８ ２ ６ ９ ２ ￥ ５ ． ５ ．
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检测猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立张锦秀1,晁生玉1,2,丁敏1,李刚1(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193; 2.青海省海西州畜牧兽医科学研究所,德令哈 817000)摘要:猪圆环病毒2型(PCV-2)O RF2(开放阅读框2)基因编码其核衣壳蛋白,它含有导致病毒致病性的多个抗原决定簇位点。
根据ORF2基因序列设计特异性引物,以感染PCV-2的Dulac细胞冻融上清为模板,克隆该开放阅读框的全基因序列。
然后以该重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计P CR引物,采用两步法,建立了检测PCV-2快速简捷的SY BR Green I荧光定量P CR方法。
多次试验证明,该方法具有良好的重复性。
同时针对与PCV-2共感染的其它病毒进行特异性检测,进一步证明该方法可以快速、特异、灵敏地检测PCV-2。
关键词:猪圆环病毒2型;Dulac细胞;SY BR Gr een I荧光定量PCR中图分类号:S852 65+9.2 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2008)09-0030-04猪圆环病毒(por cine circovirus,PCV)是迄今发现的最小的动物病毒,其粒子直径最小仅17nm,基因组也仅长约1700bp(Tischer等,1982)。
PCV 属于圆环病毒科(cir covir idae)圆环病毒属,是单股DNA病毒,粒子无囊膜。
根据其发现的先后、致病性和基因组序列的差异可将PCV分为两型,PCV-1和PCV-2。
其中PCV-2具有致病性,与多种猪病有着密切的关系,给世界养猪业带来了巨大的威胁和损失,因而各国也在对该病毒进行深入的研究。
研究发现,PCV-2中的ORF2含有多个免疫反应位点,与抗PCV-2阳性血清有特异性反应。
因此目前对ORF2的研究较深入和透彻。
ORF2主要编码核衣壳蛋白,其蛋白N端的41个氨基酸与PCV-2在细胞核中的定位有关。
对于PCV-2的鉴定和检测已有电镜观察、ELISA、IFA、ISH和PCR等多种方法。
近年来,荧光定量PCR技术以其快速、灵敏、高特异性的特点,被越来越多地用于各种病毒的检测。
本研究建立了针对PCV-2ORF2的SYBR Gr een I荧光定量PCR方法,以期在今后的临床应用中,可以高效、方便地对PCV-2进行实时监测。
1 材料与方法1.1 试验材料 PCV-2、Dulac细胞、大肠杆菌及质粒均由本实验室保存。
猪圆环病毒1型、猪细小病修回日期:2008-05-20作者简介:张锦秀(1982-),女,河北人,硕士生,研究方向:动物疫病的防制。
通讯作者:李刚,男,教授,博士生导师,研究方向:重大动物疫病的防制。
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0032007008)。
毒、猪伪狂犬病病毒均由中国兽医药品监察所毛开荣老师惠赠。
1.2 试剂与仪器 PCR试剂、限制性内切酶购自T akara公司;Bio-Easy SYBR Green I Rea-l time PCR试剂盒购自佰亿科技公司。
低温台式高速离心机(Biofug e prim oR)购自美国Sorvall公司;Rea-l time PCR仪购自美国Bio-Rad公司;Rea-l time PCR8联管购自Axy g en公司。
1.3 PCV-2ORF2全基因的扩增和克隆 根据GenBank中公布的序列,设计特异性引物扩增PCV-2ORF2全基因。
上游引物(PCV-2ORF2-F): 5 -ATGTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGG-3 ;下游引物(PCV-2ORF2-R):5 -ATGCT CGAG-CAT-TAA GGGTT AAGT GGGGGG-3 。
上游引物包含BamH I限制性酶切位点,下游引物包含X ho I限制性酶切位点。
引物由上海生物工程公司合成。
1.4 PCR反应 以感染PCV-2的Dulac细胞冻融3次后上清为模板,取3 l模板,PCV-2ORF2-F/R 各5 l,10 rT aq Buffer5 l,dNT P(各2.5 m mol/L)4 l,r Taq(5U/ l)0.5 l,加ddH2O27.5 l至终体积50 l。
PCR反应条件:94 预变性3 m in;94 变性45s,55 退火30s,72 延伸1min, 30个循环;72 延伸10min。
试剂盒回收PCR产物,经限制性核酸内切酶BamH I和X ho I双酶切后,连接到pGEX-6P-1质粒,重组质粒pGEX-ORF2经PCR与双酶切鉴定后,委托公司测序。
1.5 荧光定量PCR试验1.5.1 引物及PCR条件 以上述重组质粒为模板,选择其异于PCV-1的保守序列,设计荧光定量PCR 特异性引物,PCV -2ORF2RT -PCR -F:5 -TT CTCCTACCACTCCCGCT ACTT -3 ;PCV -2O -RF2RT -PCR -R:5 -T GGT CT ACATT T CCAGCA -GT TT GT-3 。
扩增的目的片段是ORF2全基因序列中460~584bp 的125bp 片段。
pGEX -ORF2稀释10倍测定其在波长280nm 的吸光值,计算DNA 的浓度和拷贝数。
然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板,根据Bio -Easy SYBR Gr een I Rea-l tim e PCR 试剂盒说明,PCR 反应中各组分用量如下:2 SYBR mix (含4.0mm ol/L M g 2+),10 l;PCV -2ORF2RT -PCR -F (10 mo l/L),0.4 l;PCV -2ORF2RT -PCR -R (10 mo l/L),0.4 l;Taq DN A Poly merse (5U / l),0.12 l;ddH 2O,7.08 l;pGEX -ORF2,2.0 l;总体系20 l 。
荧光定量PCR 反应采用两步法:95 预变性3min;95 变性10s,65 退火30s,循环40次。
荧光定量PCR 反应结束后制作熔解曲线程序:95 3min;55 1min;55 10s 后,0.5 /s (每秒温度递升0.5 ),到95 结束。
1.5.2 特异性检测 用引物PCV -2ORF2RT -PCR -F/R 对实验室常见菌株DH 5 和BL21及猪圆环病毒1型、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒等进行PCR 检测。
1.5.3 灵敏度分析 将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5 100拷贝/ l,以各梯度稀释液为模板进行PCR 反应。
最低起始模板浓度即为该Rea-l tim e PCR 反应的灵敏度。
2 结果2.1 pGEX -ORF2重组质粒的构建 以病毒DNA 为模板,进行PCR 反应,PCR 产物大小约750bp 。
将PCR 产物克隆进pGEX -6P -1载体,经PCR 扩增和双酶切鉴定后,最终测序结果证明重组质粒为阳性。
测序结果与GenBank 中公布的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因序列相似性为99%(图1)。
图1 PC V -2ORF2序列测序结果2.2 荧光定量PCR 结果2.2.1 扩增曲线分析 将标准质粒pGEX -ORF2进行10倍梯度稀释后,选取3.5 102~3.5 107拷贝/ l 的稀释样品作为模板进行PCR 反应,扩增曲线如图2所示。
模板浓度越高,Ct 值越小,即扩增曲线越早进入对数期。
阴性对照在36个循环后出现扩增现象,熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。
2.2.2 标准曲线分析 PCR 扩增结束后,根据起始模板浓度和相应的Ct 值绘制标准曲线。
标准曲线相关系数r 2=1.000,扩增效率E=88.3%(图3)。
2.2.3 熔解曲线分析 目的产物熔解温度为83.5 ,引物二聚体熔解温度为79 。
在3.5 102拷贝/ l 的模板浓度下,虽然也有相同熔解温度产物的产生,但是其扩增Ct 值已经与空白对照很相近,结果为阴性(图4)。
2.2.4 灵敏度分析 从扩增曲线可见,当模板浓度图2 标准质粒的扩增动力学曲线图3 标准质粒的标准曲线为3.5 103拷贝/ l时,荧光定量PCR可以扩增出特异性产物。
当模板浓度为3.5 102拷贝/ l时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带,但是其Ct值已经基本与空白对照重合。
因此该SYBR Green I Rea-l time PCR方法检测灵敏度为3.5 103拷贝/ l。
2.2.5 重复性试验结果 对于不同浓度的模板,3个平行样品之间的Ct值差异不显著,表明该方法具有很好的重复性(图5)。
2.2.6 特异性检测 针对实验室常见菌株DH5 和BL21及与猪圆环病毒共感染的其他病毒猪圆环病毒1型、猪细小病毒和伪狂犬病病毒进行特异性检测。
图6标示为猪圆环病毒2型的扩增曲线,其余模板均在30个循环后出现扩增产物,可认定为阴性,即该引物对PCV-2具有很好的特异性(图6)。
3 讨论断奶仔猪多系统衰竭综合征(postw eaning multisystemic w asting syndrome,PM WS)是近年来发现的在世界各国和地区猪群中流行的一种免疫抑制性疾病。
PCV-2是引起该病的主要病原体,对断奶后8~13周龄的猪影响尤为严重。
此外,PCV-2还与猪的皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性皮炎和坏死性淋巴结炎等疾病有关,因而实现对PCV-2快速灵敏地检测显得更加迫切。
针对PCV-2的检测已经建立了多种血清学和病原学方法。
病毒血清学检测主要为酶联免疫吸附试验(ELISA)(Naw agitgul等, 2002)。
间接ELISA是以病毒或重组表达的主要衣壳蛋白为抗原检测血清样品,其精确率为90%。
而竞争ELISA(Walker等,2000)是用细胞培养的PCV-2作为抗原与标记的特异PCV-2单抗作为竞争反应物来检测血清中的抗体水平,敏感性为99.58%。
对于病原的检测方法有免疫组织化学方法、间接免疫荧光(IFA)、抗原捕获ELISA、电镜技术、核酸探针及原位杂交技术(ISH)和聚合酶链式反应(PCR)等。
抗原捕获ELISA(McNeilly等,2002)是用抗PCV-2的抗体包被,再依次加入检测样品、兔抗PCV-2多抗及生物素标记的羊抗兔抗体来显色,以检测抗原。
Liu等(2000)建立了竞争PCR方法检测仔猪血清样本中的PCV-2,是在可扩增761或765 bp已知浓度的竞争性DNA存在条件下,再竞争性扩增502或506bp的PCV-2ORF2片段来实现试验的。
该诊断方法可以诊断PCV的感染,并确定病毒在组织细胞中的拷贝数。