kan新型乙肝压电免疫传感器的研制

第 23卷第 5期
谯康全等: 新型乙肝压电免疫传感器的研制
5 77
参照文献 [ 14 ]制 备羧 基化 碳纳米 管, 干 燥后 备用。 使用前用 5 0 mmol /L EDC和 8 0 mmo l/L NHS活化 1 h。 1. 3. 3 传感器体系的建立
将预处 理后的石英 金电极于 1 mmo l/L 半胱胺溶液 中浸泡 16h, 使晶体表面自组装形成一层半 胱胺膜, 取出 用磷酸缓冲液 ( pH = 7 4 )洗 净, 然后滴加 20 L 用 EDC 和 NHS 活化后的羧基化碳纳米管于金电极表面上, 放置 30 m in, 使羧基化碳纳米管与半胱胺膜充分作用, 然后用 磷酸缓冲液 ( pH = 7 4 )洗 去未固 定的羧基 化碳 纳米管, 随后在电极上滴 加 20 L 3mg /mL 乙肝 表面 抗体, 置于 有饱和水蒸气 的环境 反应 70m in, 使抗 体固定 于电 极上 (图 1)。
2. 3 溶液 pH值的选择 在不同的 pH 值条件下固定的抗体在相 同浓度下发
生免疫反应, 在传 感器 上得 到不同 的响 应值, 如图 4所 示。结果表明, 在 pH 值 7 4条 件下的抗体, 能 获得最大 的 活性, 其 反应结 合抗 原频率 变化 值最大, 即反应 活性 最高。
1. 3. 4 检测方法 在金电极上表面滴加 15 L 7 5 g /mL乙肝表面抗
[ 7 ] Baughm an R ay H, Zakh idov A nva r A, de H eer W a lt A. Ca r bon nano tubes the route tow ard applica tions[ J]. Sc ience, 2002, 297( 5582): 787 792.
图 5 H免疫反应响应频率值与抗原浓度的校准曲 线
在同等实验条件下, 比较进 行羧基 化碳纳米 管修饰 与不进行羧基化碳纳米管 修饰的 2种 传感器 的灵敏度, 图 6为 用 2种 传感器 检测 浓度为 7 5 g /mL 的样 品的 实时响应图。由图 6可以看出, 未修饰 羧基化碳 纳米管 的传感器的响 应峰值为 113 H z, 而修饰羧基化碳纳米管 的传感器的响 应峰值 为 145 H z。这 是因 为碳 纳米 管有 大的比表面积和生物亲和性, 固 定的抗 体量大且 抗体活 性高, 使得 与抗体 反应 的抗原 的量 大, 从而 显著提 高了 检测灵敏度。
活化后的羧基化碳纳米 管与石英 金电极 发生交联, 在 17m in - 35m in时, 频 率变 化值 趋于 稳 定, 超 过 35m in 后频率波动较大, 表明羧基化碳纳米 管在 17m in, 已在金 电极表面吸 附饱 和, 超 过 35m in 时, 因 自身 结 构的 关系 反而造成不稳定吸附。抗体在电极上 的固定化在 70m in 时频率变化值达到峰值, 并 达到稳 定。免疫反应 频率变 化的峰值出现在 58m in, 并达到稳定, 即单个 样品检测时 间约为 1h。 2. 6 传感器的稳定稳定时间
图 6 加入 碳纳米管 ( b)与未加入碳纳米管 ( a) 实时检测 HbsAg 的频率变化值比较
3 结论
半胱胺自组 装到 石英 金电 极的 表面 用于 固定 羧基 化碳纳米管, 从而构建了半胱胺 - 羧基 化碳纳米 管生物 压电 传感 器, 用于 乙肝 表面抗 原的 检测, 具 有重要 的实 际意义。经过 优化 的生物 压电 传感 器检 测乙 肝表 面抗 原是 切实 可行的, 与未 加碳纳 米管 的传感 器比较, 半胱 胺 - 羧基化碳纳米管压电传 感器检测 范围更 广、灵敏度 更高, 能够实现实时检测, 具有临床应用价值。
压电检测器 [压电 谐振电 路 (自 制 ); 压 电石 英晶体 ( AT - 切, 10 MH z, 镀 金, 晶 片 直 径 8 mm, 电 极 直 径 6 mm ); 数据采 集卡 ( 自 制 ) ; 计 算 机 ] ; 超 声 波清 洗器 (熊 猫集团南京电子计量有限公司 ); 微量移液器 ( 上海求精 生化试剂仪器有限公司 ); pH S- 3C型精密酸 度计 (上海 大普仪器有限公司 ); 氮气干燥室 (自制 )。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 石英金电极的前处理
新型乙肝压电免疫传感器的研制
谯康全, 吴永强
(四川理工学院材料与化学工程学院, 四川 自贡 643000)
Vol 23 No 5 O ct 2010
摘 要: 通过自组装半胱胺在压电石英 金电极上, 用缩合 剂 ( EDC 和 NH S )将 羧基化 碳纳米管 和
乙肝表面抗体连接到半胱胺膜, 构建乙肝表面抗原 的一种新 的生物 压电免疫 传感器。传 感器的灵 敏
图 1 检测系统单元示意图
2. 2 抗体浓度的选择 实验考察抗体探针浓度 对自身固 定量的 影响, 检测
结果可知 (图 3) , 当 HBsA b探 针浓 度为 3 mg /mL 时, 频 率变化最大为 145 H z, 故实验 中选用抗 体探 针浓度 为 3 mg /mL。
图 3 HB sAb 浓度的选择
度为 17 268 H z / ( g /mL) , 线性范围为 0 05 g /mL - 15 g /mL, 并能实时检测。
关键词: 压电免疫传感器; 碳纳米管; 乙肝表面抗原
中图分类号: R446. 62; TP212
文献标识码: A
引言
中国是乙肝的多发地区, 乙肝病毒 ( HBV ) 感染者约 1 2亿人, 占全世界患者的一半, 乙肝病毒的 病原体具有 一定的传染性, 还可导致患 者出现肝 硬化, 甚 至肝癌, 因 此, HBV 标记物的早期、准确、定量检测非 常重要。近年 来, 随着检 测技术 的不 断发展, 乙肝 血清标 记物的 检测 也在不断 改 进。目 前 常 用的 检 测 技 术有: 酶 联 免 疫测 定 [ 1]、荧光免疫测定 [ 2]、电化 学免疫 测定 [ 3] 、聚合 酶链反 应 ( PCR )技术 [ 4] 、基因芯片技术 [ 5] 和压电检测 [ 6]等。
[ 5 ] 石 龙, 赵丽英 , 刘海 燕. 客 观评 价 乙肝 病 毒基 因 检测 在 临 床诊断中的 意义 [ J] . 中 华现代临 床医学杂 志, 2005, 3 ( 4): 347.
[ 6 ] 缪 璐, 刘仲明 , 张水 华. 用 于乙 肝 表面 抗 原及 其 抗体 同 步 检测检验 杂 志, 2006, 16( 11) : 1283 1284, 1314.
[ 3 ] 王 锐, 戴小锋, 白 燕, 等. 基于巯基 自组装膜 的乙肝电化 学 免疫传感器 [ J]. 暨南大 学学报: 自然科 学版, 2009, 30 ( 5): 543 547.
[ 4 ] 鲁 军. 荧 光 定 量 PCR 检 测 乙 肝病 毒 DNA 的 临 床意 义 [ J]. 医学检验 , 2005, 5( 33): 78.
( c) 的抗原, 得到频率变化值 F, 绘 制 F- c校 正曲线 (图 5)。结果表明, 抗 原溶液在 0 05 g /mL- 15 g /mL 与传感器的响应频 率变 化值成 线性 关系, 回 归方程 为 y = 17 268 x+ 8 6976, 相 关系数 为 0 9954。在低 浓度下, 抗体 和抗 原受非 特性 结合的 影响, 会偏离 直线; 在 高浓 度下, 可结合的位点趋于饱和也会偏离直线。
石英金电极在 P iranha溶液 ( 98% H2 SO4 30% H2O2 = 3 1, v v)中浸泡清洗 3 m in, 丙酮浸泡清洗 3 m in, 去离 子水清洗 3 m in, 重复 3 次。将处理后的石英金电极在氮 气干燥室下干燥备用。 1. 3. 2 羧基化的多壁碳纳米管的制备
收稿日期: 2010 04 02 作者简介: 谯康全 ( 1976 ) , 男, 重庆长寿人, 实验师, 硕士生, 主要从事电化学方面的研究。
碳纳米 管良 好 的 导 电性、催 化 活性 和 大 的 比表 面 积, 并具有降低过电位能力和对 生物物 质的吸附 能力强 等特点 [ 7], 现已广泛用 于各种生物 传感器, 如 DNA 传感 器 [ 8 9] 、酶传感器 [ 10 11]和免疫传感器 [ 12 13] 等。
本文利 用碳 纳 米 管 比表 面 积 大、吸 附 能 力 强的 特 性, 在石英 金电极 表面 自组装 一层 半胱胺, 再通过 缩合 剂 ( EDC和 NH S )交联羧 基化碳纳 米管和 乙肝抗 体并连 接到半胱胺膜上, 研制成一种新 的乙肝 表面抗原 压电免 疫传感器。
将制备好的传 感 器放 入 4! 的 冰箱 保 存, 1 周 内探 针活性保持大于 95% , 2 周内大于 85% 。传感器在 1月 内能正常使用。
57 8
四川理工学院学报 ( 自然科学版 )
2010年 10月
2. 7 碳纳米管在传感器中的作用 在上述 优化 的 实 验 条件 下, 测 定一 系 列 不 同浓 度
1 实验部分
1. 1 实验试剂 乙肝表面抗原抗体 ( HBsAb ) (上 海科华生物 工程公
司 ); 乙肝表面抗原抗原 ( HBsAg) ( 上海科华 生物工程公 司 ); 多壁碳纳米管 ( MW CNT s) (中 科院 成都 有机 所 ); 1
- 乙基 - 3 - ( 3- 甲 基氨 丙基 ) 碳二亚 胺盐 酸盐 ( EDC ) (上海延长生化科技 发展有 限公司 ); N - 羟基琥 珀酰亚 胺 ( NH S) ( 上 海延 长生化 科技 发展 有限 公司 ) ; K2HPO4 (广东汕头 金砂 化工 厂 ); NaH2 PO4 ( 中国 成都 化学 试剂 厂 ); N aC l( 成都金山化学 试剂有限 公司 ); 半胱胺 ( 济南 汇博应用化学 研究 所有 限公 司 ) ; HNO3 ( 重庆 川东 化工 有限公司 ); N aOH ( 天 津市 福晨 化学 试 剂厂 ); H2O2 (国 际集团化学试剂有 限公司 ); H2 SO4 ( 成都金 山化 学试剂 有限公司 ); 无水乙醇 (广州化学试剂厂 ) ; 实验所用均为 去离子水, 药品均为分析纯。 1. 2 实验仪器