实验一培养基的配制及灭菌

实验一培养基的配制及灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。

一、实验目的

1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。

2．明确培养基的配制原理。

3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。

4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。

二、实验原理

灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热

灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以提供微生物生长发育所需的物质条件。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA），培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。根据培养目的不同，可分为固体培养基和液体培养基；此外，还有加富、选择、鉴别等培养基之分。就培养基中的营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂（Agar）只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在高温下熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。常用微生物培养基的配

方如下：

LB培养基配方（pH ）：

胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g

酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g

氯化钠（NaCl） 10.0 g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至，用去离子水定容至1L，在压力下灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH）：

牛肉膏 3.0 g

胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g

NaCl 5.0 g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

去离子水 1000 mL

高氏I号培养基配方（pH ）：

可溶性淀粉 20.0 g

NaCl 0.5 g

KNO

3

1.0 g

K 2HPO

4

3H

2

O 0.5 g

MgSO

47H

2

O 0.5 g

FeSO

47H

2

O 0.01g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

去离子水 1000 mL

马铃薯培养基配方（自然pH）：

马铃薯（去皮） 200.0 g

葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

去离子水 1000 mL

察氏培养基配方（自然pH）：

蔗糖（glucose） 30.0 g

NaNO

3

2.0 g

K 2HPO

4

1.0 g

KCl 0.5 g

MgSO

47H

2

O 0.5 g

FeSO

47H

2

O 0.01 g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

去离子水 1000 mL

YPD培养基配方（pH ）：

酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g

蛋白胨（Peptone） 20.0 g

葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g

琼脂粉（Agar） 20.0 g

去离子水 1000mL

在压力下灭菌20min。

三、实验材料

牛肉膏蛋白胨、高氏I 号、LB 、PDA 、YPD 、察氏等各种培养基。

四、仪器设备及用具

1. 90mm 培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH 试纸（pH ～）、记号笔、麻绳、纱布等；

2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅。

五、试剂

无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone ）、胰蛋白胨（Tryptone ）、酵母提取物（Yeast extract ）、NaCl 、琼脂粉、5mol/L NaOH 、1mol/L HCl 、KNO 3、K 2HPO 43H 2O 、MgSO 47H 2O 、FeSO 47H 2O 等。

六、实验步骤

1．洗涤

用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次，控干水分。

注意事项：

①不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。

②用过的器皿应立即洗涤。

③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。